환초석곡 (Dendrobium loddigesii)은 충북 진천 석곡농원에 서 구입하여 전남한방산업진흥원 유리온실에서 평균온도 24°C 직사광선 차광조건에서 생육시켜 환초석곡 줄기 길이가 40cm 이상이 된 것을 선별하여 줄기와 잎을 잘라 수세 후 50°C로 열풍건조기를 이용하여 일주일간 건조하였다. 그 후 건조된 환 초석곡 시료를 분쇄기를 이용하여 균일하게 분쇄한 후 MeOH 를 칭량한 시료무게의 10배를 넣고 60°C 환류냉각으로 3시간, 3회 반복하여 추출물을 제조하였다. 이 추출물을 감압농축기 (NE-1001V, Eyela, Tokyo, Japan)로 농축하여 완전히 용매를 제거한 시료를 실험 목적에 맞춰서 용매에 녹여 실험에 사용 하였다.

Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM)과 fetal bovine serum (FBS), penicillin, streptomycin, Medium 106, Low Serum Growth Supplement는 Gibco/BRL (Eggenstein-Leopoldshafen, Germany)에서 구입하였고, 3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4- sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS, CellTiter 96AQueous One Solution Cell Proliferation Assay)는 Promega (Madison, WI, USA)에서 구입하였다. α-MSH와 L-DOPA, arbutin, 합성멜라닌 은 Sigma Chemical Co. (St. Lousi, MO, USA)에서 구입하였 고, Tyrosinase antibody는 Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Dallas, TX, USA), Gapdh antibody는 Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA)에서 구입하였다.

B16F10 melanin 세포주는 한국세포주은행 (KCLB, Seoul, Korea)에서 분양 받아 10% fetal bovine serum (FBS)이 첨 가된 Dulbecco’s modified eagle's medium (DMEM)을 사용 하였고, CO₂배양기 (MCO-17A1, Sanyo, Osaka, Japan)에서 온도 37°C, 5% CO₂조건에서 배양하였다.

B16F10 세포를 96-well plate에 5 × 10³ cells/well로 세포를 분주하여 24시간동안 세포를 안정화 시킨 뒤에 환초석곡시료 를 농도별로 처리를 하였다. 24시간 배양을 한 뒤에 MTS 용 해액을 세포배양액 용액의 1/10을 첨가한 후 37°C에서 2시간 배양하였다. ELISA microplate reader (Infinite 200 pro, TECAN, Grödig, Austria)를 이용하여 490nm에서 흡광도를 측정하였다.

B16F10 세포를 6-well plate에 5 × 10⁴ cells/well로 세포를 분주하여 24시간동안 세포를 안정화 시킨 뒤에 arbutin 100μg/mℓ과 환초석곡시료를 농도별로 10, 50, 100, 200μg/mℓ 처리를 하였고 1시간 뒤에 α-MSH를 100 nM이 되게 처리를 한 뒤에 72시간 동안 배양을 하였다. PBS로 2회 세척을 하고 RIPA protein lysis buffer을 처리를 한 후에 4°C에서 30분 동안 incubation을 하였다. 4°C에서 13000 rpm으로 30분 동안 원심분리 후 단백질이 포함된 상층액만을 대상으로 하여 tyrosinase activity를 측정하였다. 단백질 양은 Bradford 정량법 (Bradford, 1976 )을 통해 ELISA microplate reader (Infinite 200 pro, TECAN, Grödig, Austria)를 이용하여 595nm에서 측정하였고 동일한 단백질을 이용해서 L-DOPA를 처리를 하 여 540nm 흡광도로 세포내 tyrosinase activity를 측정하였다.

B16F10 세포에 60mm 세포배양접시에 5 × 10⁴ cells/well로 세포를 분주하여 arbutin 100μg/mℓ 과 환초석곡추출물을 α- MSH (100 nM)보다 1시간이전에 처리를 하고 72시간동안 배 양을 하였다. 그 후에 PBS로 2회 세척하고 Trypsin-EDTA를 처리하여 세포를 수확한 뒤 3000 rpm에 5분 동안 원심분리하 여 세포를 모으고 상층액을 제거한 후 10% dimethylsulfoxide (DMSO)가 첨가된 1N NaOH용액을 처리하여 80°C에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응액을 대상으로 ELISA microplate reader (Infinite 200 pro, TECAN, Grödig, Austria)를 이용하 여 410nm에서 각각의 흡광도를 측정하였으며 멜라닌 양은 합 성 melanin을 기준으로 하여 작성된 표준곡선에서 멜라닌을 정량하였다.

미백관련 유전자 발현을 확인하기 위해서 B16F10 세포를 60mm 세포배양접시에 1 × 10⁵ cells/well로 세포를 분주한 후 24시간 배양한다. 환초석곡추출물을 다양한 농도로 1시간 동 안 처리 한 뒤 α-MSH (100 nM)로 melanin 생성을 유도하여 24시간동안 배양을 하고 PBS로 2회 세척 후 세포를 수확하였 다. 수확한 세포는 Tripure Isolation Reagent (Roche, Basel, Switzerland)를 이용하여 RNA를 분리하였다. 5μg의 mRNA (total RNA)를 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 실험은 제조사 매뉴얼에 따라 수행하였 다. 합성된 cDNA 1μℓ, taqman primer 1μℓ, Taqman Universal Master Mix II (Appiled Biosystem, Foster City, CA, USA) 10μℓ, 3차 증류수 8μℓ를 넣고 Real-time PCR기 기 (ABI7500, Applied Biosystem, Foster City, CA, USA) 를 이용하여 PCR을 수행하였다. 정량 중합 효소 반응에 쓰인 TaqMan gene은 http://www.lifetechnologies.com/kr/ko/home/ life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-assays.html에서 검색 하여 주문 후 사용하였고 분석하고자 하는 유전자 특이적 gene의 정보는 Table 1에서 나타내었다. 또한 real-time PCR 반응 조건은 50°C에서 2분, 95°C에서 10분 동안 1회 수행하 고, 변성 온도 95°C에서 15초 annealing 온도 60°C에서 15초 로 40회 반복 수행하였다.

Western blot을 이용하여 tyrosinase 단백질의 발현 정도를 분석하였다. PAD 시료를 농도별로 처리한 실험군과 대조군을 24시간 배양 후 62.5mM Tris-HCl (pH 6.8), 2% SDS, 5% β-mercaptoethanol, 2mM phenyl-methylsulfonyl fluoride, protease inhibitors (Roche, Manngeim, Germany), 1mM Na₃VO₄, 50mM NaF과 10 mM EDTA을 함유하는 완충제를 사용하여 세포를 용해시켰다. 세포 용해액을 15,000 g로 4°C에 서 30분간 원심 분리하여 단백질만 포함하고 있는 상층액만을 얻었다. 정량한 단백질 20μg을 10% SDS-PAGE에 전기 영 동시킨 후 PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane (BIO-RAD, Richmond, CA, USA)으로 옮겼다. 그리고 membrane의 blocking은 5% bovine serum albumin (BSA)이 함유된 TTBS (0.1% Tween 20 + TBS) 용액을 상온에서 2시 간 동안 실시한 다음 tyrosinase, GAPDH및 대한 1차 항체와 반응시킨 후 2차 항체인 horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit 또는 anti-mouse IgG를 반응시키고 ECL detection reagents (Millipore, Billerica, MA, USA)를 사용하여 단백질 의 발현정도를 확인하였다.

본 실험에서 얻은 결과에 대해서는 평균치 ±표준편차 (means ± SD)로 나타내었으며, 대조군과 각 실험군과의 평균 차이는 student’s t-test로 분석하여 p-value 값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다.

환초석곡 (Dendrobium loddigesii) 메탄올 추출물의 B16F10 세포주에서 세포독성에 미치는 농도을 조사하기 위해 MTS 실험을 수행하였다. 각각 B16F10 세포에 농도별 (10, 50, 100, 200μg/mℓ)로 환초석곡 추출물을 처리하고 24시간 후 에 MTS를 처리한 결과, 10, 50, 100, 200μg/mℓ 처리한 농 도에서는 독성이 없는 것으로 나타났다 (Fig. 2).

Fig. 2.  Effect of DL on cell viability in melanoma (B16F10) cells.

Cell viability was evaluated with the MTS assay. Data represent the means ± SD of triplicate determinations from three separate experiments.

환초석곡 추출물이 B16F10 세포주에서 melanin 생합성에 미치는 영향을 확인하기 위해, 환초석곡 추출물 (25, 50, 100, 200μg/mℓ)과 대조군인 arbutin 100μg/mℓ 을 처리한 후 1시간 뒤에 α-MSH를 처리하여 melanin 생성을 유도한 후 72시간 배양하여 전체 melanin 함량을 비교하였다. 그 결과, α-MSH 를 단독으로 처리한 세포군에 비해 환초석곡 추출물시료를 처 리한 군에서 농도 의존적으로 melanin 함량이 감소되는 것을 알 수 있었다 (Fig. 3). 또한 환초석곡 추출물 시료 100, 200μg/mℓ 처리한 그룹에서는 유의성 있게 감소되는 것을 확 인할 수 있었다. 이는 환초석곡 메탄올 추출물이 미백 효과가 있음을 알 수 있다.

Fig. 3.  Effect of DL on melanin contents in melanoma cells.

Cells were seeded at 5 × 10⁴ cells/well. After 24 hours, cells were treated with several concentrations of DL, arbutin 100μg/mℓ and α- MSH (100 nM) cultured for 72 hours. Melanin contents were measured as described in materials and methods. Data are means ± SD of three experiments performed in triplicate (*p < 0.05 versus α-MSH treatment alone, **p < 0.01 versus α-MSH treatment alone).

환초석곡 추출물이 α-MSH의해 증가된 tyrosinase 활성에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위해 세포내 tyrosinase 활 성도를 확인하여 보았다. 그 결과, α-MSH에 의해 tyrosinase 활성도가 증가한 것을 확인할 수 있었고 이를 환초석곡 추출 물에 의해 α-MSH에 의해 증가된 tyrosinase 활성을 낮출 수 있는 것을 확인하였다 (Fig. 4). 이는 환초석곡추출물 시료가 tyrosinase 활성을 낮춤으로써 미백기능을 할 수 있음을 시사 한다.

Fig. 4.  Effect of DL and α-MSH on tyrosinase activity in melanoma cells.

Cells were seeded at 5 × 10⁴ cells/well. After 24 hours, cells were treated with several concentrations of DL, arbutin 100μg/mℓ and α-MSH (100 nM) cultured for 72 hours. Tyrosinase activity were measured as described in materials and methods. Data are means ± SD of three experiments performed in triplicate (*p < 0.05 versus α-MSH treatment alone, **p < 0.01 versus α-MSH treatment alone).

Tyrosinase는 melanin 생합성에 결정적인 효소로 알려져 있다. 환초석곡추출물에 의해 tyrosinase 단백질 발현에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위해, B16F10 세포주에 농도별 (25, 50, 100, 200μg/mℓ)처리를 한 후 72시간 배양을 하였다. 그 결과 tyrosinase 단백질의 양이 두드러지게 환초석곡 추출 물시료를 처리하였을 때 농도 의존적으로 감소되는 것을 확인 할 수 있었다 (Fig. 5).

Fig. 5.  Effect of the methanol extracts of DL on α-MSH induced tyrosinase protein expression in B16F10 cells.

B16F10 cells were seeded at 1 × 10 5cells/dish. After 24 hours, cells were treated with several concentrations of the methanol extracts of DL, arbutin 100μg/mℓ and α-MSH (100 nM) cultured for 72 hours. Expression of tyrosinase protein were measured as described in materials and methods. Data are means ± SD of three experiments performed in triplicate.

환초석곡 메탄올추출물이 멜라닌 합성 관련 유전자의 발현 에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위해 B16F10 세포주에 α-MSH와 환초석곡 시료를 처리하여 24시간 후에 real-time PCR로 유전자발현을 확인하였다. 그 결과 환초석곡 메탄올 추 출물은 α-MSH에 의해 증가된 MITF, TRP1, TRP2의 mRNA level을 농도 의존적으로 감소되는 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 6).

Fig. 6.  Effect of DL on expression of MITF(A), TRP- 1(B) and TRP-2(C) mRNA in melanoma cells.

Cells were seeded at 1 × 10⁵ cells/well. After 24 hours, cells were treated with several concentrations of DL and α-MSH (100 nM) cultured for 24 hours. Expression of MITF, TRP-1 and TRP-2 mRNA were measured as described in materials and methods. Data are means ± SD of three experiments performed in triplicate (*p < 0.05 versus α-MSH treatment alone, **p < 0.01 versus α-MSH treatment alone).

본 실험에서는 중국에서 약용석곡으로 사용되고 있는 환초 석곡 메탄올 추출물의 melanin 생성 억제효능 및 tyrosinase activity 측정하고 미백관련 유전자 발현확인과 western blot을 이용하여 tyrosinase 단백질의 발현 정도를 분석하였다. 환초석 곡 메탄올 추출물이 B16F10 세포주에 독성이 없는 농도에서 처리한 결과 멜라닌 합성이 100, 200μg/mℓ 농도에서 유의성 있게 감소되는 것을 양성대조군인 arbutin과 비교하여 확인할 수 있었다. 이에 따라 환초석곡 추출물이 멜라닌 합성을 저해 하는 것을 확인하였고, 멜라닌 합성에 가장 중요한 단백질인 tyrosinase의 활성도 및 단백질 발현량이 환초석곡 추출물을 처 리함에 따라 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, melanin 합성과 관련된 key효소들의 유전자발현을 억제하는 것을 확인 할 수 있었고, 환초석곡 메탄올 추출물이 MITF와 관련된 신 호전달을 억제하여 멜라닌 합성 관련물질들인 tyrosinae, TRP1, TRP2를 저해하여 최종적으로 멜라닌 생합성을 억제하 는 것을 확인할 수 있었다.

위 연구결과들을 토대로 환초석곡 메탄올추출물은 효과적인 미백 기능성 화장품 소재로 사용가능할 것으로 보이며, 이를 위해서는 효율적인 추출법, 전임상 동물실험 그리고 유효성분 의 개발과정이 수반되어야 한다고 사료된다.