본 실험에 사용된 산벚나무 (Prunus sargentii)가지는 2011 년 6월 전라남도 나주시 야산에 자생하는 산벚나무에서 분리 한 것으로 수세하여 40℃에서 건조시킨 후 4℃ 이하로 냉장 보관하였으며, 표품은 동신대학교 생물자원산업화지원센터 (BIC)에 보관되어 있다.

건조된 산벚나무 가지를 마쇄한 후 75% Ethanol (EtOH)을 이용하여 80℃에서 환류추출을 실시하였다. 추출액은 여과, 농 축 및 동결건조를 실시하여 9.40%의 수율로 추출물을 획득하 였고, 이중 일부를 증류수에 분산시킨 후 chloroform, ethyl acetate, n-butanol을 사용하여 용매분획을 실시하였다. 분획된 시료는 여과, 농축 및 동결건조하여 분말화하였다. 추출물과 분획물은 4℃ 이하로 냉장보관하면서 실험에 사용하였으며, 분 획수율은 BuOH 분획 (BF)과 Aqueous 분획 (AF)이 각각 39.82%, 35.11%로 높게 나타났으며 CHCl₃ 분획 (CF)은 8.65%, EtOAc 분획 (EF)은 16.42%로 나타났다.

한국생명공학연구원 생물자원센터 (BRC)에서 분양받은 Propionibacterium acnes (KCTC3314) 균주는 Reinforced Clostridial Medium (RCM, Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA)을, Staphylococcus aureus (KCTC3881), Staphylococcus epdermidis (KCTC1917) 균주는 nutrient broth 및 agar (Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, USA)를 이용하여 항균활성 실험에 사용하였다. 세포독성 시험과 NO 생성 억제실험에 사용된 동물세포주인 Raw 264.7은 BRC에서 분양 받은 것을 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, WelGENE, Gyeongsan, Korea) 에 10% Fetal Bovine Serum (FBS, Gibco, Carlsbad, CA, USA)과 1% penicillin-streptomycin (Gibco, Carlsbad, CA, USA)을 혼합한 배지를 이용하여 실험에 사용하였다. 그 외 사 용된 모든 시약들은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)을 통하여 구입, 사용하였다.

Folin-Denis법을 이용하여 75% EtOH 추출물 및 분획의 polyphenol 함량을 측정하였다 (Folin and Denis, 1912). 1㎎/㎖농도로 Methanol (MeOH)에 용해시킨 시료액과 Folin- Denis reagent를 1 : 1로 혼합하여 3분간 반응시킨 뒤 동량의 10% Na2CO3를 혼합하여 1시간동안 암실에서 반응시킨 후, 상 등액을 취하여 700㎚에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질인 tannic acid를 MeOH에 0 - 500㎍/㎖의 다양한 농도로 용해시 켜 시료와 동일한 방법으로 표준 검량선을 작성하고 총 polyphenol 함량을 ㎎/g로 나타내었다. 한편, 페놀성 화합물중 여러 기능성을 가지는 것으로 알려진 flavonoid 함량을 알아보 기 위해 Moreno 등 (2000)의 방법을 변형하여 flavonoid 함 량을 측정하였다. MeOH에 1㎎/㎖ 농도로 용해시킨 시료액 100㎕와 1M potassium acetate 20㎕, 10% aluminium nitrate 20㎕, MeOH 860㎕를 혼합하여 40분간 반응시킨 후 415㎚에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 사용한 rutin을 MeOH에 0 - 500㎍/㎖의 다양한 농도로 용해시켜 시료와 동 일한 방법으로 표준 검량선을 작성하고 총 flavonoid 함량을 ㎎/g으로 나타내었다.

1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)을 사용하여 radical 소거능을 측정하여 항산화 활성을 비교하였다 (Blois, 1958). MeOH에 일정농도로 용해시킨 시료액 20㎕와 MeOH에 200 μM로 용해시킨 DPPH 용액 180 ㎕를 혼합하여 20분간 암실에서 반응시킨 후 517㎚에서 흡광도를 측정하여 50%의 radical을 소거하는데 필요한 농도 (SC₅₀)를 계산하였다. Positive control로 천연 항산화제로 알려진 L-ascorbic acid를 사용하 였다.

NO 소거능은 Marcocci 등 (1994)의 방법을 변형하여 다음 과 같이 측정하였다. 10mM sodium nitroferricyanide (Ⅲ) dihydrate 50㎕와 증류수에 0.1 - 5 ㎎/㎖의 농도로 용해시킨 시 료액 30㎕를 혼합하여 150분 동안 25℃에서 반응시켰다. 30% acetic acid에 용해시킨 1% sulfanilamide 60㎕를 혼 합하고 5분후 60% acetic acid에 용해시킨 0.1% N-(naphtyl) ethylenediamine dihydrochloride 60㎕를 혼합하여 실온에서 30 분간 반응시킨 후 520㎚에서 흡광도를 측정하여 50%의 NO를 소거하는데 필요한 농도 (SC₅₀)를 계산하였으며, positive control 로 L-ascorbic acid를 사용하였다.

Disc diffusion assay를 이용하여 산벚나무 가지 추출물과 분획의 항균활성을 비교하였다. 계대 배양된 각 균주 배양액 (10⁷- 10⁸CFU/㎖)을 100㎕씩 항균시험용 평판배지에 분주한 후 멸균 면봉을 이용하여 도말하였고, 시료를 6㎜의 paper disc에 1.0, 5.0㎎이 되도록 천천히 흡수시킨 뒤 건조한 후 평판배지 위에 밀착시킨 상태로 24시간 배양한 후 disc를 중 심으로 생성된 생육저해환 (clear zone, ㎜)을 측정하여 항균활 성을 비교하였다. P. acnes 균주의 배양에는 5% CO₂가 공급 되는 incubator를 활용하였다.

96 well plate에 Raw 264.7 세포를 1 × 10⁵ cells/well이 되 도록 분주하고 24시간 동안 5% CO₂, 37℃ 조건에서 배양한 후, 농도별 시료액과 LPS (2㎍/㎖)를 혼합하여 24시간 동안 배양하였다. 각 well에서 세포 배양액을 50㎕씩 회수하여 새 로운 plate에 옮기고 50㎕의 1% sulfanilamide (in 5% H₃PO₄)를 혼합하여 10분간 반응시킨 후, 다시 50㎕의 0.1% N-(naphtyl)ethylenediamine dihydrochloride (in H₂O)를 혼합 하여 상온에서 10분간 반응시켜 540㎚에서 흡광도를 측정하 였다. 시료액 대신 PBS를 가하여 blank를 측정하였으며, 표준 물질로 sodium nitrite를 농도별로 희석하여 시료액과 같은 방 법으로 흡광도를 측정하여 작성한 검량선을 이용하여 NO 생 성량을 산출하였다 (Ding et al., 1988).

추출물 및 분획의 세포독성은 MTT assay 방법에 의해 측 정하였다 (Shin et al., 2003). 96 well plate에 1 × 10⁴ cells/ well의 농도로 배양된 Raw 264.7 세포를 분주하여 24시간 배 양하여 부착 및 안정화를 시킨 후, 다양한 농도로 조제한 시 료를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 2.5㎎/㎖의 농도로 제조한 MTT 용액 (in PBS)을 각 well에 20㎕씩 가하고, 37℃, 5% CO₂ 조건에서 4시간 동안 반응시켜 MTT가 환원되 도록 하였다. 배지를 제거한 후, 각 well에 생성된 formazan 결정을 용해시키기 위하여 100㎕의 DMSO를 첨가하여 540㎚에서 흡광도를 측정하였으며, 시료액 대신 PBS를 사용 한 well의 흡광도를 기준으로 세포 생존율 산출하였다.

모든 측정값은 3회 이상 반복 실험한 결과의 평균값과 표준 편차 (means ± SD)로 표시하였고, 각 실험군 간의 통계학적 분석은 windows용 SPSS 12.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하였다. 각 군 간의 측정치 비교는 one-way analysis of variance (ANOVA)를 시행하였으며, 유의성은 신 뢰구간 p < 0.05에서 의미를 부여하였다.

약용 자원식물 중에 존재하는 polyphenol 화합물은 phenolic hydroxyl기를 가지는 방향족 화합물로서 활성산소를 제거하여 항산화 활성이나 항암 활성, 항염증, 항알레르기 등 의 생리활성에 관여하는 것으로 알려져 있다 (Sivaranjani et al., 2013). 한편, 전형적인 페놀성 화합물로서 C₆-C₃-C₆의 기 본구조를 가지는 flavonoid의 polyphenolic한 성질은 free radical을 없애주는 항산화 활성을 비롯하여 항암, 항균 등 다 양한 생리활성을 가지는 것으로 알려져 있다 (Dewick, 2002).

산벚나무 가지의 추출물과 용매 분획별 시료의 polyphenol 과 flavonoid 함량을 측정한 결과, 추출물 중 polyphenol 함 량이 277.92㎎/g으로 나타났고, 용매 분획별 시료에서 EF와 BF의 함량이 각각 311.92㎎/g, 419.11㎎/g으로 추출물보다 높 게 나타났으며, CF, AF의 함량은 각각 91.46㎎/g, 96.18㎎/g 으로 추출물보다 현저히 낮은 함량을 보여주었다 (Table 1). Flavonoid 함량에서도 이와 유사한 양상으로 나타났는데, 추 출물의 flavonoid 함량이 20.36㎎/g이었으나, EF과 BF의 flavonoid 함량이 각각 27.22㎎/g, 27.40㎎/g으로 추출물보다 높게 나타났다. 플라보노이드, 페놀산 등 페놀화합물을 다량 함유하고 있다고 알려진 베리류의 EtOH 추출물의 총 폴리페놀 함량을 살펴보면 아로니아G/블랙초크베리 (Aronia G, Aronia melanocarpa, GreenField s.c.)가 138.81㎎/g로 가장 높은 함량 을 보여주었는데 이는 산벚나무 가지 추출물보다 2배정도 낮은 수치였다. 플라보노이드 함량도 총 폴리페놀 함량과 유사하게 베리류 중 가장 높은 함량을 보여준 아로니아G/블랙초크베리 가 3.68㎎/g이었으나, 산벚나무 가지 추출물은 20.36㎎/g으로 5배 정도 높은 함량을 나타내었다 (Li and Jeong, 2015). 이 러한 결과는 산벚나무의 항산화 활성을 비롯하여 항암, 항균 등 다양한 생리활성을 탐색하는 일차적인 자료가 될 수 있을 것으로 사료된다.

산벚나무 가지의 추출물과 용매 분획별 시료의 DPPH radical 소거능 측정에서 50%의 DPPH radical을 소거하는데 필요한 시료의 농도를 산출한 SC₅₀ 값과 positive control로 사 용된 ascorbic acid의 SC₅₀ 값을 기준으로 비교한 relative activity를 Table 2에 나타내었다. BF의 SC₅₀ 값이 19.75㎍/㎖ 로 30.13㎍/㎖인 추출물보다 높은 활성을 보여주었다. 이와 같은 SC₅₀ 수치는 relative activity에 나타난 바와 같이 BF의 활성이 135.62% 수준으로 positive control보다 높은 수준의 항산화 효과를 보여주었다.

식물체내의 페놀화합물은 2차 대사산물로서 항산화, 항균 등 다양한 생리활성을 나타내며 특히 페놀성 화합물의 함량이 높 으면 자유라디칼 소거능도 우수한 경향이 있다고 보고되고 있 다 (Anagnostopoulou et al., 2006). 이와 같이 페놀 화합물 함량과 항산화 활성간의 상호작용에 대한 많은 연구결과들에 서 알 수 있듯이 (Choi et al., 2003; Velioglu et al., 1998) 산벚나무 가지 BF의 항산화 활성은 높은 폴리페놀 함량에 기 인한 결과인 것으로 판단되어진다.

외부상처에 대한 반응 및 염증 같은 면역방어기전의 다양한 과정을 매개하는 Interleukin 1 (IL-1)이나 Tumor Necrosis Factor (TNF) 등에 의해 유도된 inducible Nitric Oxide Synthase (i-NOS)에 의하여 생성되는 NO는 혈액응고 및 혈압 조절, 암세포에 대한 면역기능 등의 역할을 수행하는 물질이 지만, 인체에 과량 존재하면 세포손상, 염증 반응, 뇌막염, 알 츠하이머병과 파킨슨병 같은 퇴행성 질환에 중요한 요인으로 작용하는 등의 유해한 영향을 미치게 된다. 또한 superoxide 음이온 (O²⁻)과 반응하여 생성된 peroxynitrite (ONOO⁻)는 매 우 반응성이 높고 독성이 강한 산화제로 반응 속도는 H₂O₂의 수천 배에 이르며 짧은 시간 동안 급속한 신경세포손상을 유 발하는 것으로 보고되고 있다 (Park and Yang, 2008).

산벚나무 가지의 추출물과 용매 분획별 NO 소거능 측정에 서 50%의 nitric oxide를 소거하는데 필요한 시료의 농도를 산출한 SC₅₀ 값을 Table 3에 나타내었다. BF의 SC₅₀ 값이 93.17㎍/㎖로 90.70㎍/㎖인 추출물과 비슷한 수준의 활성을 보여주었다. Positive control의 SC₅₀ 값을 기준으로 비교한 relative activity에 나타난 바와 같이 추출물과 EF와 BF의 활 성이 257.34 - 355.74%의 수준으로 positive control인 ascorbic acid보다 월등히 높은 수준의 NO 소거활성을 보여주었다.

피부질환 중 대표적인 여드름은 일반적으로 유전적 소질 및 피지생산의 증가, P. acnes의 증식 등의 주요인자가 복합적으 로 작용하여 발생하는 것으로 알려져 있다 (Cunliffe et al., 2004). 물론 미생물학적인 원인균도 P. acnes 뿐만이 아니라 피부 상재균인 S. aureus, S. epidermidis 등과 같은 균주들이 관여하는 것이 일반적이다 (Ki et al., 2005).

Disc diffusion assay를 활용하여 여드름 원인균에 대한 항 균활성 비교한 결과를 Table 4에 나타내었다. P. acnes에 대한 항균활성 결과를 살펴보면, 5㎎/disc 농도로 처리하였을 경우 추출물은 16.08㎜의 생육저해환을 형성하였으며, EF가 20.63㎜의 생육저해환을 형성함으로써 가장 높은 활성을 나 타내었다. 1㎎/disc로 처리하였을 때에는 CF와 EF가 각각 11.70㎜와 17.19㎜의 생육저해환을 형성함으로써 10.58㎜ 의 생육저해환을 형성한 추출물보다 높은 활성을 보여주었다. S. aureus, S. epidermidis에 대한 항균활성의 결과를 살펴보면 5㎎/disc 농도로 처리하였을 경우 EF에서 가장 큰 활성을 보 여주었다. 하지만 여드름 원인균인 세 균주에 대한 CF가 가지 는 항균활성은 세포독성에서 기인된 항균활성으로 사료되어 진다. 이와 같은 항균활성은 산벚나무의 다른 부위인 잎 추출 물 및 용매별 분획의 항균활성 (Yang et al., 2012)과 비교하 였을 때, 산벚나무 가지 추출물 및 분획이 산벚나무 잎 추출 물 및 분획 보다 높은 활성을 보여줌으로써 활용가능성은 충 분히 있는 것으로 판단되었다.

그람 음성균의 세포외막에 존재하는 독소인 LPS는 macrophage에 작용하여 inflammatory cytokine의 발현과 함께 NO의 생성을 촉진하는 것으로 알려져 있다 (Lee et al., 2004; Song and Lee, 2015). LPS로 염증반응이 유도된 Raw 264.7 cell에서 산벚나무 가지의 추출물과 분획의 NO 생성 억 제활성을 측정한 결과 (Fig. 1), CF를 100㎍/㎖의 농도로 EF를 500㎍/㎖의 농도로 처리하였을 때, 각각 268.58 pg/㎖, 238.38 pg/㎖의 NO를 생성함으로써 높은 NO 생성 억제능을 보여주었다. CF의 경우에는 500㎍/㎖의 농도로 처리하였을 때에도 268.58 pg/㎖의 NO 생성량을 보여주었지만 세포독성 에 기인한 활성으로 확인되어 적절한 농도의 설정이 필요할 것으로 판단되었다. 추출물과 BF의 경우에는 이미 생성되어 있는 NO를 소거하는 활성은 높지만, NO의 생성을 억제하는 활성은 소거하는 활성에 비해 낮은 것으로 판단되었다.

Fig. 1  Nitric oxide production inhibitory activity of the extract and fractions from blanches of Prunus sargentii in Raw 264.7 cell.

EX; 75% Ethanol extract of P. sargentii, CF; Chloroform Fraction, EF; Ethyl acetate Fraction, BF; Butanol Fraction, AF; Aqueous Fraction. Mean values ± SD from triplicate separated experiments are shown. *Means within a column followed by the same letter are not significant based on the DMRT (p < 0.05).

한편, LPS로 NO의 생성을 촉진시킨 상태에서 산벚나무 가 지의 추출물과 용매별 분획의 Raw 264.7 세포에 대한 세포독 성을 측정한 결과를 Fig. 2에 나타내었다. CF를 500㎍/㎖로 처리하였을 때, 세포 생존률이 15.90%로 독성을 나타냈으며, 추출물과 다른 분획의 경우에는 80% 이상의 세포 생존률을 보여줌으로써 세포독성을 나타내지 않았다.

Fig. 2  Raw 264.7 cell viabilities of the extract and fractions from blanches of Prunus sargentii by MTT assay.

EX; 75% Ethanol extract of P. sargentii, CF; Chloroform Fraction, EF; Ethyl acetate Fraction, BF; Butanol Fraction, AF; Aqueous Fraction. Mean values ± SD from triplicate separated experiments are shown. *Means within a column followed by the same letter are not significant based on the DMRT (p < 0.05).

이상의 결과에서 75% EtOH 추출물의 BF이 활성물질군인 polyphenol과 flavonoid 함량을 바탕으로 항산화 활성을 확인 하기 위해 실시한 DPPH radical 소거능과 NO 소거활성 측정 에서 가장 높은 항산화 활성을 보여주었다. 여드름을 유발하 는 원인균으로 밝혀진 P. acnes, S. aureus, S. epidermidis에 대한 항균활성에서 추출물, CF와 EF가 강력한 항균활성을 나 타내었는데 CF의 항균활성은 세포독성에 기인한 항균활성으 로 판단되어진다. NO 생성 억제 활성에서는 CF와 EF에서 높 은 NO 생성 억제활성을 확인할 수 있었다. 하지만 CF를 고 농도로 처리하였을 때, 세포독성이 확인되어 적절한 농도의 설 정이 필요할 것으로 판단되었다. 추출물과 BF의 경우에는 생 성되어있는 NO를 소거하는 활성은 좋지만 NO의 생성을 억 제하는 활성은 낮은 것으로 나타났다. 따라서 추가적인 연구 를 진행한다면 산벚나무 가지 EF의 경우 여드름 원인균에 대 한 항균활성을 이용한 기능성 소재로서 그리고 CF와 EF의 경 우 항염증 관련 활성을 가지는 소재로서의 개발이 가능할 것 으로 판단되었다.