비타민나무 (Hippophae rhamnoides L.)의 열매와 잎은 강 원비타민나무영농조합 (Chuncheon, Korea) 농장에서 7 월에 수확한 것을 제공받아 사용하였고, 착즙기 (galaxy premium juicer GJ-120, NUC Co., Ltd., Daegu, Korea)로 비타민나무 열매를 착즙한 후 inline-mixer [IM002 (YSY), K&S Co., Ltd., Hwaseong, Korea]를 이용하여 균질화 시키고, micro filter (1㎛)를 통과시켜 여과하였다. 이후 분액여두를 이용하여 여과액을 수용성 (FW)과 지용성 (FF)분획으로 나누고, 동결건 조 (Ilshin Biobase Co., Ltd., Seoul, Korea.)를 실시하여 각각 3.86과 5.73%의 수율로 분말 (juice powder)을 획득하였다.

또한 비타민나무열매를 착즙하고 남은 부산물을 동결 건조 하여 분말화한 후에 초임계추출장치 (SFE-2&5LF-2-FMC-50, Waters, Milford, MA, USA)에 넣어 total flow rate (CO₂ flow rate, co-solvent rate)를 50 g/min으로 흘려주었고, cosolvent로는 ethyl alcohol (Daejung Chemicals and Metals Co., Ltd., Siheung, Korea)을 사용하였다. 추출온도는 60℃, 압력은 350 bar 조건에서 3 시간동안 추출하였다. 추출물을 40℃에서 감압농축하고, 동결 건조하여 5.26%의 수율로 초임 계 추출물 (BS)을 얻을 수 있었다.

또한 잎과 열매 혼합처리 시 높은 활성을 나타낸 연구 (Han et al., 2009)를 참고하여 진행한 선행연구결과, 높은 DPPH 소거활성을 나타낸 비타민나무 잎과 열매 혼합분말을 실험에 사용하였다 (data not shown).

건조된 비타민나무 잎은 70% EtOH로 추출하여, 감압 농축 하였고 열매는 착즙하여, 여과한 후 동결건조 하였다. 28.19% 수율의 건조된 잎 분말과 9.59% 수율의 열매 착즙 분말을 6 : 4의 비율로 혼합한 혼합물 (MIX)을 실험에 사용하였다.

총 phenol성 화합물 함량은 Folin-Ciocalteu 방법을 변형하 여 측정하였다 (Singleton and Rossi, 1965).

각 시료 0.1㎖ 를 0.05㎖의 Folin-Ciocalteu (Sigma- Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 시약과 혼합하고, 5 분 반응 후에 20%의 탄산나트륨 0.3㎖를 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 15 분 동안 안정화시킨 후 증류수 1㎖를 첨가하여 725㎚에서 흡광도를 측정하였다.

시료의 총 phenol성 화합물함량은 표준물질로 사용된 gallic acid (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)의 표준검량 곡선을 이용하여 gallic acid equivalents (GAE)로 나타내었다.

총 flavonoid 함량은 Moreno 등 (2000)의 방법을 변형하여 측정하였다.

80% ethanol로 희석한 시료 0.1㎖ 에 10% aluminium nitrate (Yakuri Pure Chemicals Co., Ltd., Osaka, Japan) 0.02㎖, 1M potassium acetate (Junsei Chemical Co., Ltd., Tokyo, Japan) 0.02㎖ 와 80% ethanol 0.86㎖을 가하여 실 온에서 40 분 반응시켰다. 반응이 끝난 후 415㎚에서 흡광 도를 측정 하였으며, 총 flavonoid 함량은 표준물질인 quercetin (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 검량곡 선을 이용하여 정량한 후 quercetin equivalents (QE)로 나타 내었다.

DPPH radical 소거 활성은 Blois (1958)의 방법을 변형하여 측정하였다.

다양한 농도의 시료 0.1㎖를 0.15 mM의 DPPH (2,2- diphenyl-1-picrylhydrazyl, Sigma-Aldrich Co., St. Louis,MO, USA) 0.1㎖와 혼합하여 상온, 암조건에서 30 분간 반 응시킨 후, UV/VIS spectrophotometer (V530, Jasco Inc., Tokyo, Japan)를 이용하여 517㎚에서 흡광도를 측정하였다.

농도에 따른 radical 소거능의 기울기를 구하여 50%가 되는 시점의 시료의 농도를 IC₅₀ (㎍/㎖)로 나타내었고, 양성대조군 으로는 ascorbic acid (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)를 사용하였다.

환원력은 Oyaizu (1986)의 방법을 변형하여 실험하였다.

다양한 농도의 시료 0.1㎖에 0.2M의 sodium phosphate buffer (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 0.1㎖ (pH 6.6)와 1% potassium ferricyanide (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 0.1㎖를 혼합하여 50℃에서 20 분 동 안 반응시킨 후, 10% trichloroacetic acid (Wako Pure Chemical Industries Ltd., Osaka, Japan) 0.1㎖를 첨가하여 동량의 증류수와 0.1% ferric chloride (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 0.05㎖를 첨가하여 700㎚에서 흡광 도를 측정하였다.

RAW264.7 세포는 한국 세포주 은행 (Seoul, Korea)에서 구입 하였으며, 세포배양에 사용한 Dulbeco’s modified Eagle’s medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), penicilin/streptomycin solution (PS), phosphate buffered saline (PBS)는 HyClone사 (Logan, UT, USA)로부터 구입하 여 사용하였다. 10% FBS와 1% 항생제 (PS, 100 U/㎖)가 첨 가 된 DMEM 배지를 사용하여 CO₂ 인큐베이터에서 배양하 였다.

시료에 대한 세포독성은 96 well plate에 RAW264.7 세포 를 1 × 10⁵ cells/well로 분주하여 24 시간 동안 배양한 후, LPS와 시료가 첨가된 배지에서 24 시간 배양하고, phosphatebuffered saline (PBS)에 녹인 MTT (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)를 0.5㎎/㎖의 농도로 처리하여 4 시간 더 배양시킨 후 상등액을 제거하고 각 well에 100㎕의 DMSO 를 처리하여 ELISA (Model 680, Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 540㎚에서 흡광도를 측정하였다 (Mosmann, 1983).

Nitrite oxide (NO)생성은 griess reagent system을 이용하여 측정하였고, griess reagent에 사용되는 모든 시약은 Sigma- Aldrich (St. Louis, MO, USA)사에서 구입하였다.

96 well plate에 RAW264.7 세포를 1 × 10⁵ cells/well로 분 주하여 24 시간동안 배양하고, LPS와 시료가 첨가된 배지로 교체하여 24 시간 배양 후, 상등액 50㎕와 griess reagent (A reagent; 1% sulfanilamide, B reagent; 5% phosphoric acid에 녹인 0.1% N-(1-naphthyl)-ethylenediamine dihydrochloride) 50㎕를 혼합하여 10 분간 반응 시킨 후 540㎚에서 흡광도 를 측정하였다 (Green, 1982).

Elastase 저해활성은 Cannell 등 (1988)의 방법에 따라 측정 하였으며, 실험에 사용되는 모든 시약은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)사에서 구입하였다.

각 시료를 일정농도가 되도록 조제하고, 100 mM tris-HCl buffer (pH 8.6)에 녹인 porcine pancreas elastase (0.25 U/㎖) 용액을 첨가하여, 100 mM tris-HCl buffer (pH 8.6)에 녹인 기질 N-succinyl-(L-Ala)3-p-nitroanilide을 가하고, 37℃에서 20 분간 반응시킨 후, 기질로부터 생성되는 p-nitroanilide의 생 성량을 415㎚에서 측정하였다. Elastase 저해활성은 시료용액 의 첨가구와 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.

모든 데이터는 최소 3 반복 수행하여 평균 ±표준편차로 나 타냈으며, 각 실험군의 통계처리는 Minitab (version17.2; Minitab Inc., State College, PA, USA)을 사용하여 One-way ANOVA를 실시하였으며, 유의적 차이가 있는 항목에 대해서 는 Tukey’s Honest Significant Difference (HSD)를 이용하여 통계학적 유의성을 분석하였다 (p < 0.05).

비타민나무 (Hippophae rhamnoides L.)열매와 잎으로 제조 한 4 종 sample의 총 phenol성 화합물 및 flavonoid 함량은 Table 1에 나타내었다. 열매와 잎의 혼합물인 MIX의 경우 225.7㎎·GAE/g으로 가장 높은 phenol성 화합물 함량을 나타냈 으며, 그 다음으로 FW (14.08㎎·GAE/g) > BS (10.99㎎·GAE/ g) > FF (8.96㎎·GAE/g)의 순이었다. 총 flavonoid 함량도 총 phenol성 화합물과 같이 MIX (25.18㎎·QE/g)가 가장 높은 함량을 나타냈고, FW (5.86㎎·QE/g) > BS (1.91㎎·QE/g) > FF (0.29㎎·QE/g)의 순이었다.

Yogendra 등 (2013)에 의하면 비타민나무 부위별 phenol성 화합물의 함량은 잎이 가장 많고, 열매와 과육이 그 다음을 차지한다고 하였다. 또한 대표적인 polyphenol 화합물인 플라 보노이드 함량은 건조된 잎 100 g당 310 - 2,100㎎ 함유되어 있다고 보고되었다 (Barl et al., 2003).

Phenol성 화합물은 다른 화합물과 쉽게 결합하는 특성을 가 진 히드록시기 (–OH)를 포함하고 있어 항산화, 항암, 항콜레 스테롤 작용을 하며, 식이성 polyphenol 화합물을 많이 섭취하 는 경우 암, 심혈관 질환, 염증, 신경변성 질환 등 여러 질병 의 위험을 감소시킨다 (Vauzour et al., 2010; Lee et al., 2017). 또한 체내조직을 보호하며 생리적 효율성을 높임으로 써, 식물에 phenol성 화합물의 함량이 많을수록 높은 항산화 활성을 나타내는 것으로 알려져 있다 (Duval and Shetty, 2001).

DPPH는 전자 또는 수소를 받으면 radical이 소거되어, 517㎚ 부근에서 흡광도가 감소한다. 이러한 DPPH를 이용한 측정법은 항산화 작용기작과 연관성이 높고 항산화 활성을 빠 르게 측정할 수 있어, 식물추출물의 전자 공여능 연구에 많이 이용되고 있다 (Ahn et al., 2015).

비타민나무 열매와 잎으로 제조한 4 종 sample의 DPPH radical 소거능은 Table 2에 나타냈다. MIX가 10.27㎍/㎖의 RC₅₀ 값으로 가장 높은 radical 소거 활성을 나타냈으며, 그 다 음으로 FW > FF > BS 순으로 소거활성이 감소했다. 이 결과 는 총 phenol성 화합물 및 flavonoid 함량과 유사한 것으로 DPPH radical 소거활성이 폴리페놀의 함량과 상관관계가 있다 는 Dudonné 등 (2009)의 보고와 일치한다. 또한 Kumar 등 (2013)은 비타민나무 잎의 용매별 추출물의 항산화 활성 연구 에서 총 phenol성 화합물함량이 높은 추출물일수록 DPPH radical소거능이 증가하는 것을 확인하였으며, 75% ethanol 추 출물이 가장 높은 활성을 나타는 것으로 보고하였다.

환원력은 항산화활성을 나타내는 물질이 ferric-ferricyanide (Fe³⁺)를 ferrous (Fe²⁺)로 전환시키는 전자전달 능력을 측정하 는 방법으로 시료에 포함된 총 phenol성 화합물로부터 수소원 자를 공여 받음으로써 Fe³⁺의 감소가 일어나며, Fe³⁺에서 Fe²⁺ 로 환원시키는 강도가 클수록 발색의 정도가 증가하여 높은 흡광도 수치를 나타낸다. (Meir et al., 1995; Yildirim et al., 2001).

비타민나무 4 종 sample의 환원력은 농도가 증가함에 따라 흡광도 값이 증가하였다 (Fig. 1). 전체적으로 항산화제인 ascorbic acid에 비해 낮은 환원력을 보였으나, 비타민나무 4 종 sample 중 잎과 열매의 혼합물인 MIX의 경우 가장 높은 환원력을 나타냈고, FF는 흡광도 값을 얻을 수 없었다.

Fig. 1  Reducing power of functional materials from Hippophae rhamnoides by different concentrations.

FW; water-soluble fruit powder, FF; fat-soluble fruit powder, BS; by-product supercritical extract of fruit, MIX; mixture of leaves and fruit. Mean values ± SD from triplicate separated experiments are shown. *The data were statistically analyzed using Tukey’s Honest Significant Difference (HSD), and differences were assessed to be significant at 5% level of probability (p < 0.05).

MTT 를 이용하여 비타민나무 4 종 sample의 세포 생존율 에 대한 효과를 측정하였다. RAW264.7 cell에 500㎍/㎖의 농 도로 sample을 처리하였을 때, FW, FF, MIX 모두 99% 이 상의 세포 생존율을 나타냈으나 BS의 경우 21% 의 생존율을 보였다 (Fig. 2). LPS로 유도된 RAW264.7 cell에서 NO 생 성 억제에 대한 결과는 Fig. 3에 나타냈다.

Fig. 2  Effects of functional materials from Hippophae rhamnoides on cell viability in RAW264.7 cells.

FW; water-soluble fruit powder, FF; fat-soluble fruit powder, BS; by-product supercritical extract of fruit, MIX; mixture of leaves and fruit. Mean values ± SD from triplicate separated experiments are shown. *The data were statistically analyzed using Tukey’s Honest Significant Difference (HSD), and differences were assessed to be significant at 5% level of probability (p < 0.05).

Fig. 3  Effects of functional materials from Hippophae rhamnoides on LPS-induced NO production in RAW 264.7 cell.

FW; water-soluble fruit powder, FF; fat-soluble fruit powder, BS; by-product supercritical extract of fruit, MIX; mixture of leaves and fruit. Mean values ± SD from triplicate separated experiments are shown. *The data were statistically analyzed using Tukey’s Honest Significant Difference (HSD), and differences were assessed to be significant at 5% level of probability (p < 0.05)..

대식세포는 외부 병원체가 침입했을 경우, 백혈구보다 빠른 반응을 보임으로써 면역, 염증 반응에 중요한 역할을 한다 (Kim et al., 2014). 대식세포인 RAW264.7 cell에 박테리아성 내독소 인 LPS (lipopolysaccharide)를 처리하였을 때, proinflammatory cytokine이 증가 하면서 NO, PGE2 등 염증 매개 물질의 분 비가 증가 한다 (Kamata et al., 2002).

이러한 염증 매개 물질들의 과도한 생성은 다양한 만성 염 증성질환의 발병에 원인이 되며, 특히 과도한 NO의 생성은 염증반응을 촉진하고 염증매개체의 생합성을 유도함으로써 세 포손상, 유전자변이를 일으키고 알츠하이머와 파킨슨병 같은 퇴행성 질환의 원인이 된다 (Hippeli and Elstner, 1999; Park and Yang, 2008). Fig. 4

Fig. 4  Inhibitory effects on elastase activity by functional materials from Hippophae rhamnoides by different concentrations.

FW; water-soluble fruit powder, FF; fatsoluble fruit powder, BS; by-product supercritical extract of fruit, MIX; mixture of leaves and fruit. Mean values ± SD from triplicate separated experiments are shown. *The data were statistically analyzed using Tukey’s Honest Significant Difference (HSD), and differences were assessed to be significant at 5% level of probability (p < 0.05).

Fig. 3에서와 같이 500㎍/㎖의 농도로 sample을 처리하였 을 경우, 모든 sample에서 NO 생성을 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 특히 FF와 MIX의 경우 세포독성은 나타나지 않았 으나, 각각 25.26, 27.75%의 낮은 NO 생성율을 나타내며, RAW264.7 cell 내에서 NO 생성을 억제하는 것을 알 수 있 었다. 또한 BS의 경우 28.93%로 낮은 NO 생성율을 보였으 나 이는 세포 독성에서 기인된 결과로 설명할 수 있다. 이상 의 결과를 통해 LPS로 유도된 RAW264.7 cell에서 FF와 MIX가 NO 생성을 효과적으로 억제함으로써, 염증을 조절할 수 있는 천연소재로 이용이 가능함을 확인할 수 있었다.

Elastase는 동물결합 조직의 불용성 탄성 단백질 elastin을 분해하는 백혈구 과립효소로 진피조직의 그물망 구조결합을 파괴하여 피부의 주름 및 탄력성 감소를 유발한다 (Yoo et al., 2010). 따라서 피부노화의 중요한 원인 중의 하나인 elastase의 활성을 억제함으로써 피부노화를 억제할 수 있다 (de Witt et al., 1981; Um et al., 2017a).

비타민나무 4 종 sample의 elastase 저해 활성을 측정한 결 과 모든 sample이 50, 100, 200, 500㎍/㎖ 농도가 증가함에 따라 억제활성이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 특히 500㎍/㎖의 농도에서 FW가 43.69%의 억제율을 보이며 가장 높은 활성을 나타냈으며, FF가 22.31%로 가장 낮은 elastase 저해활성을 나타냈다.

비타민나무 열매에는 수용성 vitamin인 vitamin C가 약 695㎎/100 g 함유되어 있다고 알려져 있으며 (Christaki, 2012), Yang 등 (2016)은 0.1㎎/㎖ 농도에서 vitamin C가 65.1%의 elastase 저해율을 나타냈다고 보고하였다. 즉, 수용성 열매 분말인 FW의 elastase 저해 활성은 vitamin C의 활성에 서 기인된 것으로 예측할 수 있다.

본 연구에서는 비타민나무 (Hippophae rhamnoides L.)를 이용한 화장품 신소재를 개발하기 위해 열매와 잎을 이용한 4 종의 sample을 제조하여 항산화 활성, NO 생성억제, elastase 저해 활성을 측정하였다. 비타민나무열매와 잎을 이용한 4 종 sample의 총 phenol성 화합물과 총 flavonoid 함량은 MIX가 가장 높은 것으로 나타났다. DPPH radical 소거능도 MIX가 가장 높은 활성을 나타냈으며, 환원력측정 결과 모든 sample 이 농도 의존적으로 증가하였고, MIX가 가장 높은 환원력을 보였다. 이러한 결과는 높은 총 phenol성 화합물 및 flavonoid 의 함량에서 기인한 것으로 예상할 수 있다. 또한 LPS로 유 도된 RAW264.7 cell에서 MIX와 FF가 500㎍/㎖의 농도에 서 NO의 생성을 억제하고, 세포독성도 나타나지 않았다. 이상 의 결과로 볼 때, 비타민나무 잎과 열매 혼합물인 MIX는 항 산화 및 염증 조절하는 천연소재로 가능성이 있음을 시사한다.

BS의 경우 NO 생성을 억제하였으나 세포생존율이 감소하 는 결과를 보임으로써, 향후 연구를 진행할 때 세포독성을 나 타내지 않으며 NO 생성 억제효과를 보이는 적정농도의 선정 이 요구된다.

비타민나무 착즙액은 vitamins, fatty acids, free amino acids 등 유효성분이 포함되어 있으며, 특히 vitamin C와 carotenoids의 함량이 매우 높은 것으로 보고되었다. Carotenoid 의 함량은 종자 (67.5㎎/100 g)에 비해, 과육 (350㎎/100 g)에 서 높게 나타나며, vitamin E의 경우 착즙액이 216 ㎎/100 g 으로 종자 (92.7㎎/100 g)보다 높은 함량을 나타냈다 (Zed, 2004). Chemat 등 (2012)은 착즙 부산물의 초음파추출물의 경 우 총 carotenoids 함량이 63.84㎎/ℓ, β-carotene의 함량이 18.06㎎/ℓ이라고 보고하였다.

Elastase 저해활성을 측정한 결과 모든 sample이 농도가 증 가함에 따라 억제활성이 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 FW의 경우 가장 높은 elastase 억제활성을 나타내, 주름 개선 기능성 소재로 이용 가능성이 있음을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 바탕으로 비타민나무 기능성 소재를 대상으로 항 산화, 항염, 주름개선 효과의 관련기전의 연구를 진행한다면, 기 능성 화장품 소재로서의 활용 가치가 높아질 것으로 생각된다.