국제홀리스틱힐링교육원에서 전나무 (A. holophylla Maxim) 로부터 화장품 원료로 사용할 오일 성분 추출 후 남은 전나무 부산물을 분양받아 실험에 이용하였다.

강원도 평창군 진부면의 전나무 잎을 채취하여 잔가지 제거 후 상온에서 1 주간 건조후 3㎏을 선별하여 100℃로 3 시간 동안 스팀추출기로 정유 추출한 후 남은 전나무 부산물을 실 험에 이용하였다. 항미생물 검정에 쓰인 공시균주는 생물자원 센터로부터 분양받았으며, Bacillus subtilis, (KCTC number 3728), S. aureus (KCTC number 1916), Salmonella typhimurium (KCTC number 1925), Klebsiella pneumoniae (KCTC number 2001), 이상의 4 가지 미생물을 실험재료에 사용하였다.

화장품 오일 원료 추출후 남은 전나무 잎 부산물을 60℃의 건조기 (VS-1202D4N, Vision Scientific Co., Ltd., Daejeon, Korea)에서 건조시킨 후, 막자사발을 이용하여 분쇄하였다.

분쇄한 샘플은 물 온도별 (50℃와 100℃), 에탄올 (Daejung, Siheung, Korea) 농도별 (35%, 50%, 70%, 100%)로 나누어 추출하였다. 추출된 용액을 여과지 (MN020250, HYUNDAI Micro Co., Seoul, Korea)에 여과하여 농축하였고, 농축된 시 료를 50% 에탄올로 녹여 데이터 측정을 위해 시료를 준비하 였다.

DPPH를 이용한 항산화 활성값 측정은 Blois (1958)의 방법 을 변형한 Yoo 등 (2017)의 실험 방법에 따라 실험을 수행하 였다.

50 ppm농도로 준비한 100㎕ 샘플에 100㎕ 0.15 mM DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl; Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)를 첨가하여, 암상태 상온에서 30 분 반응 시킨 후, UV-VIS spectrophotometer 기기 (Multiskan FC Microplate Photometer, Thermo Fisher Scientific Instruments Ltd., Waltham, MA, USA)를 이용하여 517㎚에서 흡광도 값 을 측정하였다. DPPH 라디컬 소거능은 10㎍/㎖ ascorbic acid (Amresco LLC., Solon, OH, USA)를 대조군으로 사용 하여 백분율 (%)로 계산하여 나타내었다.

ABTS를 이용한 항산화 활성값 측정은 Re 등 (1999)의 방 법을 변형한 Jeon 등 (2016)의 실험 방법에 따라 실험을 수 행하였다.

1 : 1 ABTS 혼합용액 [7.4 mM ABTS (2,2'-azino-bis-3- ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid; Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) + 2.6mM potassium persulfate (Daejung Chemicals and Metals Co., Ltd., Siheung, Korea)]을 암상태 로 실온에서 24 시간 반응시킨 후 UV-VIS spectrophotometer 를 이용하여 732㎚에서 흡광도 값이 0.70 (± 0.03)이 되는지 확인하였다. 준비된 용액을 phosphate saline (PBS, pH 7.4) 을 이용하여 희석하여 990㎕에 10㎕ 샘플을 첨가하여 10 분 반응시킨 뒤 740㎚로 UV-VIS spectrophotometer를 세팅 한 후 흡광도 값을 측정하였다. 대조군으로는 10㎍/㎖ ascorbic acid를 사용하였고, 50 ppm 농도인 각 샘플의 흡광 도 값을 백분율로 환산하여 나타내었다.

총 페놀 함량을 측정하기 위하여 수행된 실험은 Folin- Ciocalteu 가 고안한 방법을 약간 변형하여 응용하였다 (Taga et al., 1984).

100㎕ 샘플 (1,000 ppm)에 50㎕ Folin & Ciocalteu’s phenol 시약을 첨가하여 3 - 5 분 동안 반응시킨다. 20% Na2CO3 (Junsei Chemical Co., Ltd., Tokyo, Japan) 용액을 300㎕ 취하여 위의 반응 샘플에 첨가한 후, 15 분 동안 반응 시킨다. 마지막으로 1㎖의 distilled water를 넣고 2 분 동안 원심분리하여 96 well plate에 200㎕씩 분주한다. 725㎚로 세팅된 UV-VIS spectrophotometer 기기를 이용하여 흡광도 값을 조사하였다.

총 플라보노이드 함량 측정을 위해서 Moreno 등 (2000)의 방법을 변형한 Kim 등 (2016b)의 실험 방법에 따라 수행하 였다.

E-tube에 100㎕의 10% aluminum nitrate (Junsei Chemical Co., Ltd., Tokyo, Japan)과 1M potassium acetate (Junsei Chemical Co., Ltd., Tokyo, Japan)를 혼합한 후, 500㎕ 샘플 (1,000 ppm)을 넣고 40 분간 반응시킨다. 반응 후 96 well plate에 150㎕씩 분주하고, 415㎚로 세팅된 UV-VIS spectrophotometer 기기를 이용하여 흡광도 값을 조사하였다.

전나무 부산물의 항미생물 활성을 측정하기 위해 그람양성 군에 속하는 Staphulococcus aureus (KCTC number 1916), Bacillus substilis (KCTC number 3728)와 그람 음성군인 Salomonella typhimurium (KCTC number 1925), Klebsiella pneumonia (KCTC number 2001)를 분양받아 실험에 이용하 였다.

4 가지 미생물은 LB (bacto-tryptone 10 g/ℓ, bacto-yeast 5 g/ℓ, NaCl 10 g/ℓ, pH 5.8)배지에 배양해서 50% glycerol 을 첨가하여 –80℃에 장기간 저장하였다. 실험을 위하여 장기 간 저장된 4 가지 미생물을 새로운 LB 액체 배지를 이용하여 37℃에서 배양한 것을 이용하였다.

미생물 최소 저해 농도 활성 (minimun inhibitory concentratio, MIC)은 샘플을 2 배씩 연속적으로 희석하여 체크하 였다. 이 MIC 설험의 모든 절차는 Kobayashi 등 (1993)이 사용한 방법을 고안하여 실험을 수행하였다.

멸균된 액체 배지를 이용하여 7.8 - 1,000㎍/㎖ 농도가 되도 록 맞추고, 최종 양은 샘플당 200㎕가 되도록 96 well micro plate에 준비하여 37℃에서 24 시간동안 150 rpm으로 배양하면서 체크하였다. 대조군으로는 tetracyclin (1,000 ppm) 을 사용하였고, 모든 MIC 활성은 3 반복으로 측정하여 결정 하였다.

MIC법 분석에서 스크리닝한 미생물 중 항미생물 효과를 나 타낸 Staphylcoccus aureus 균을 대상으로 전나무 부산물의 disc diffusion법을 이용한 항균활성 정도를 분석하였다 (Seo et al., 2016).

제조한 LB agar 배지에 10⁷- 10⁸ CFU/㎖로 희석한 균 배 양액을 100㎕ 도말하였다. 균을 도말한 후, paper disc를 샘 플 (100㎎/㎖)에 흡수되도록 하여 균 도말한 배지에 접종하여 37℃에서 24 시간 동안 배양 정도를 관찰하였다. 생성된 clear zone을 측정하여 추출용매와 농도에 따른 항균 활성을 비교분 석하였다.

모든 데이터는 최소 3 반복 수행하여 평균 ± 표준편차로 나타냈었다. 통계처리는 종합 소프트웨어 IBM SPSS Statistics v24 (SPSS, Chicago, IL, USA)를 사용하여 Duncan’s Multiple Range Test (DMRT)로 유의성을 검증하였고, 통계적 유의성을 5% 수준에서 분석하였다.

인체 내의 다양한 대사과정에서 생성되는 활성산소로 인한 산화적 스트레스로 인해 각종 만성 질병 등이 심화되고 있으 므로, 이런 문제를 해결할 수 있는 천연 항산화제를 개발하고 자 하는 연구가 활발히 이루어지고 있다 (Jeon et al., 2009).

대부분 천연 식물로부터 유래된 페놀 화합물로 인해 항산화 력이 있는 항산화제에 대한 연구와 역할 구명에 대한 연구가 많이 진행되어 왔다 (Lee et al., 2005). 현재까지 많이 쓰이고 있는 항산화제는 BHA와 BHT 로서 안정성은 뛰어나지만, 합 성성분 물질이기 때문에 천연 성분 유래의 항산화제 개발 성 과를 기대하고 있는 실정이다 (Huang et al., 1992). 현재 많 이 알려진 천연항산화제는 폴리페놀, 플라보노이드, 카로티노 이드, 아스코르브산, 토코페롤 등이 이에 속한다 (Huang et al., 1992).

화장품 원료로 쓰이는 정유 성분을 먼저 추출하고 남은 전 나무 (A. holophylla Maxim) 부산물에 잔존하는 항산화 활성 을 측정하기 위해 DPPH와 ABTS radical 소거능을 측정하여 백분율로 나타내었다 (Fig. 1, 2). DPPH와 ABTS radical 소 거능 활성 샘플은 50 ppm의 농도에서 항산화 활성을 보여주 는 것으로 나타났다.

Fig. 1  Antioxidant effect using DPPH scavenging activity in Abies holophylla byproduct depending on temperature and concentrations of solvent. Means values from triplicate separated experiments are shown.

*Means with difference letters are significantly different at p < 0.05 by Duncan’s Multiple Range Test (DMRT).

Fig. 2  Antioxidant effect using ABTS scavenging activity in Abies holophylla byproduct depending on temperature and concentrations of solvent.

Means values from triplicate separated experiments are shown. *Means with difference letters are significantly different at p < 0.05 by Duncan’s Multiple Range Test (DMRT).

DPPH radical 소거능 분석을 통해 50℃와 100℃ 열수 추 출물에서 각각 95.61%, 99.42%로 높은 항산화 수치가 검정되 었다. 에탄올 농도가 높아질수록 추출물에 대한 DPPH 전자소 거능이 낮아지는 것으로 나타났다. DPPH radical 소거능 수치 의 결과에서 보면, 50℃와 100℃라는 추출 온도에 있어서는 항 산화활성 차이가 나타나지 않았으며, 에탄올은 50% 이상 농도 로 추출한 결과 항산화능이 오히려 낮아지는 것으로 나타났다.

일반적으로 높은 항산화능을 나타내기 위해 쓰이는 에탄올 을 용매로 이용하지 않아도 열수추출을 하면 높은 항산화활성 을 나타나는 것으로 조사되었다 (Fig. 1).

ABTS radical 소거능을 측정한 결과, 35% 에탄올로 추출했 을 때 61.27%로 가장 낮은 항산화능을 갖는 것으로 나타났다. ABTS radical 소거능 측정의 경우는 용매 농도별, 물 온도별 항 산화능의 차이가 크게 나타나지 않는 것을 확인할 수 있었다. 하지만, 전체적인 항산화 수치 패턴은 DPPH radical 소거능 수치 양상과 유사한 경향을 보여주는 것으로 나타났다 (Fig. 2).

전나무를 이용한 항균과 항염에 관한 연구는 많이 시행되어 왔지만, 항산화에 대한 연구는 극히 제한적이다. 소나무과 4 종을 이용한 항산화 활성 분석 보고에서 나무껍질, 잎 등 부 위별로 나누어 에탄올 추출물로 DPPH radical 소거능 분석법 을 이용하여 측정한 결과, 껍질 부분에서는 4 종의 수종 모두 ascorbic acid와 유사한 항산화 활성을 나타냈으며, 잎부분도 100㎍/㎖에서 대조구로 쓰인 표준물질보다 항산화능이 높은 것으로 나타났다 (Ahn and Bae, 2005).

소나무의 솔방울의 ethyl acetate 분획물의 DPPH와 ABTS radical 소거능을 측정한 결과, 추출물 농도가 증가될수록 DPPH와 ABTS radical 소거능 활성이 증가하는 것으로 보고 되었다 (Jang et al., 2016). 소나무과에 속하는 전나무의 잎 부위를 이용한 항산화 연구에서, 조추출물에서는 항산화능이 나타나지 않았고, 잎 추출물의 각 분획물에서만 항산화능이 있 는 것으로 조사되었다 (Lee et al., 2006).

이와는 달리, 본 연구에서는 전나무 부산물 조추출물을 가 지고 실험한 결과 항산화능이 있는 것으로 조사되었다. 이미 화장품에 쓰이는 많은 정유성분을 추출한 상태이기 때문에 활 성이 없을 것으로 생각되었지만, 실험해 본 결과 전나무 부산 물에서도 항산화능이 조사된 것으로 보아, 전나무 부산물을 이 용하여 화장수나 농업적 이용 제품 등의 2 차 산업 제품을 개발할 수 있을 것으로 사료된다.

총 페놀 함량이 가장 높은 것으로 측정된 샘플은 50% 에 탄올 추출물로서 389.84㎎·GAE/g로 나타났다. 가장 낮은 총 페놀 함량 수치는 2.03㎎·GAE/g으로서, 50℃ 열수추출물 조 건인 것으로 조사되었다. 열수추출물 보다는 에탄올 추출물에 서 전반적인 총 페놀 함량은 높은 것으로 나타났다 (Fig. 3). 플라보노이드 함량은 열수추출물 샘플에서는 0.01㎎·QE/g 이 하의 수치로 나타나, 50%와 100% 에탄올 추출물과 비교하면 15 배 정도 (0.15㎎·QE/g)추출물에 총 플라보노이드 함량이 많은 것으로 조사되었다.

Fig. 3  Total phenol content in Abies holophylla byproduct depending on temperature and concentrations of solvent.

Means values from triplicate separated experiments are shown. *Means with difference letters are significantly different at p < 0.05 by Duncan's Multiple Range Test (DMRT).

소나무의 솔방울 추출물의 총 페놀성 화합물 함량은 27.3 ± 0.3㎎/g 으로 보고되었다 (Jang et al., 2016). P. densiflora 톱밥으로부터 추출한 정유 성분에는 약 5.7%의 페놀성 화합 물이 조사되었고, 수피에서는 5.1%의 페놀성 화합물이 존재하 고 있는 것으로 밝혀졌다 (Ku et al., 2007; Patra et al., 2015). 소나무 껍질 추출물 (PineXol^®)의 총 페놀성 화합물과 총 플라보노이드 함량은 각각 717.40 ± 6.86 GAE·㎎/g, 54.44 ± 0.01 QE·㎎/g으로 측정되었다 (Lee et al., 2013).

본 연구에서 측정된 총 페놀성 화합물 함량 389.84㎎·GAE/ g 수치는 전나무 정유 성분을 1 차 추출 후 남은 부산물을 이 용한 추출물로부터 확인된 수치로서, 전나무를 화장품 원료로 제공하는 정유 성분 1 차 추출 후에도 상당한 페놀 함량이 남아 있는 것으로 확인되어 부산물을 이용한 2 차 화장수 제 품화도 가능할 것으로 보인다.

4 가지 박테리아 (S. aureus, B. subtilis, S. typhimurium, K. pneumonia)에 대한 전나무 부산물의 항박테리아 활성을 측 정하기 위해 먼저 MIC방법으로 조사하였다. 4 가지 박테리아 중 S. aureus만이 각 추출 샘플마다 항미생물 활성이 있는 것 으로 밝혀졌다. Fig. 4

Fig. 4  Total flavonoid content in Abies holophylla byproduct depending on temperature and concentrations of solvent.

Means values from triplicate separated experiments are shown. *Means with difference letters are significantly different at p < 0.05 by Duncan's Multiple Range Test (DMRT).

각 농도별 에탄올 추출물에서는 S. aureus에 대해 8 ㎍/㎖ 이하의 박테리아 저해 활성이 나타났으며, 각 온도별 열수추 출물에 있어서는 125㎍/㎖ 이하의 박테리아 저해능이 있는 것으로 확인되었다. 전나무 부산물 추출물은 나머지 3 가지 박 테리아에 대해서는 항미생물 활성이 없는 것으로 조사되었다 (Table 1).

전나무 부산물 추출물이 항미생물 활성을 보여주는 S. aureus 균을 사용하여 paper disc diffusion법을 이용한 항미생 물 저해능을 더 심층적으로 분석하였다. tetracycline을 대조군 으로 하여 조사한 결과, 에탄올 농도별 (35%, 50%, 70%, 100%) 미생물 고체 배지에서의 paper disc 주변에 나타나는 clear zone을 육안으로 확인할 수 있었다 (Fig. 5).

Fig. 5  Antimicrobial activity against Staphylcoccus aureus.

T; tetracycline (positive control), –; 50% EtOH (negative control), A; 35% EtOH extract of Abies holophylla byproduct, B; 50% EtOH extract of Abies holophylla byproduct, C; 70% EtOH extract of Abies holophylla byproduct, D; 100% EtOH extract of Abies holophylla byproduct, E; 50℃ extract of Abies holophylla byproduct, F; 100℃ extract of Abies holophylla byproduct.

Paper disc 주변의 clear zone을 육안으로 확인한 결과, 온도 별 열수추출물을 제외한 나머지 조건 추출물 처리에서는 clear zone을 형성하는 것으로 보여져 전나무 부산물의 각 농도별 에 탄올 추출물에서 S. aureus에 대한 높은 항박테리아 활성을 나 타내는 것으로 조사되었다. 육안으로 확인된 clear zone을 측정 한 결과, 35%와 50% 에탄올추출물은 10 ㎜ 미만의 clear zone 이 측정되었으며, 50% 와 100% 에탄올추출물을 이용한 실험군 에서 10㎜이상의 clear zone이 형성되어 S. aureus에 대한 높은 항미생물 활성을 보여주는 것으로 재차 확인되었다 (Table 2).

전나무의 에센셜 오일 추출물을 retention fraction (RF)별로 나누어 실험한 결과, fraction D (RF value: 0.3)에서 K. pneumoniae와 S. pyogenes에 대한 항박테리아 활성이 crude oil을 이용한 실험구보다 더 높은 것으로 보고되었다 (Lee et al., 2014). 항진균 활성에 대한 연구는 2 가지 전나무 (A. holophylla와 A. koreana)종의 에센셜 오일을 이용하여Candida glabrata에 대한 항균 활성이 높은 것으로 보고되었다 (Lee and Hong, 2009). 전나무의 에센셜 오일 성분에 대한 항미생 물 활성은 몇가지 보고된 사례의 연구가 되어 있으나, 전나무 부산물을 이용한 항균 활성 연구는 본 연구에서 처음으로 다 루는 것으로 전나무 부산물에 대한 항박테리아 활성 이외에도 항진균에 대한 활성도 연구할 가치가 있을 것으로 사료된다.

본 연구에서 화장품 원료로 1 차 정유 성분을 추출한 전나 무 부산물을 이용한 다양한 항산화 활성 정도와 항박테리아 활성을 검정하였다. 이상의 결과들로부터 DPPH radical 소거 능, ABTS radical 소거능, 총 페놀성 화합물 함량, 총 플라보 노이드 함량의 수치 확인 결과, 부산물임에도 불구하고 높은 항산화 활성이 있는 것으로 나타났으며, S. aureus 박테리아에 대한 항박테리아 활성도 지니고 있는 것으로 확인되었다. 따 라서 전나무 부산물은 기능성 원료로서 2 차 산업화 제품의 응용 가능성이 있을 것으로 기대된다.