본 실험에 사용한 노루오줌 [Astilbe chinensis (Maxim.) Franch. Et Savat.]의 전초는 2015년 8월경에 전남 장흥 (위도 34.53‘23“N, 경도 126.91‘59“E)에서 채취하였으며, 대한민국 약전 (KP)을 근거로 하여 목포대학교 한약자원학과 김휘 교수 에게 의뢰하여 식물학적 동정을 거친 뒤 사용하였고 실험에 사용된 시료의 확증표본 (TKM-210⁸)은 한약진흥재단 한약자 원본부에 보관하고 있다.

노루오줌은 멸균수로 수세한 뒤 50℃ 온도의 열풍건조기에 서 일주일간 건조하였다. 건조된 시료는 분쇄기로 분쇄하여, 시료 100 g에 에탄올을 500㎖ 가한 뒤 100℃ 조건에서 3 시 간 3 회 반복하여 추출하였다. 추출된 시료는 filter paper (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)를 이 용하여 여과하고, 여과액을 동결 건조하여 시료를 PBS (phosphate buffered saline)에 녹인 뒤 사용하였다.

그리고 HCT-116 세포주는 한국세포주은행 (KCLB, Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였다. Dulbecco’s modified Eagel’s medium (DMEM, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)에 10% fetal bovine serum (FBS, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA), 1% penicillin/streptomycin을 첨가하여 사용하였고. 37℃, 5% CO² 조건에서 배양하고 사용하였다.

세포생존율은 CellTiter 96® aqueous one solution cell proliferation assay (Promega Co., Madison, WI, USA)를 사 용하고 제조사에서 제공한 protocol에 따라 실험을 진행했다.

HCT-116 세포를 96 well plate에 5 × 10⁴ cells/㎖ 농도가 되도록 분주하고, 세포를 96 well plate에 2 × 10⁵ cells/㎖ 농 도가 되도록 분주한 뒤 37℃, 5% 배양기에서 24 시간 배양한 후 노루오줌 에탄올 추출물을 각각 31.3, 62.5, 125, 250 그 리고 500㎍/㎖ 농도로 24 시간 동안 처리하였으며, MTS 시 약 20㎕를 넣고 2 시간 동안 배양한 뒤 microplate reader infinite® 200 PRO (TECAN, Mannedorf, Switzerland)를 이 용하여 490㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다.

세포생존율은 정상대조군에 대한 생존율을 %로 표시하였고 나타난 결과에 따라 추출물들의 암세포 사멸효과와 H₂O₂ 처 리에 대한 세포생존율을 측정하였다.

Caspase-3 단백질의 활성도는 caspase-3 colorimetric detection kit (Enzo Life Sciences Inc., Farmingdale, NY, USA)를 이용해 측정하였다. HCT-116 세포는 차가운 PBS로 세척한 뒤 Pierce™ protease and phosphatase inhibitor mini tablets (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)가 포함된 RIPA cell lysis buffer 2 (Enzo Life Sciences Inc., Farmingdale, NY, USA)로 얼음위에서 1 시간 동안 용해하였다.

세포용해액은 원심분리기로 4℃, 13,000 × g 조건에서 20 분간 원심분리 하였고, 단백질 농도를 bradford assay를 이용하여 측정하였다. 총 20 ㎍의 단백질을 사용해 제조사 가 제공한 프로토콜에 따라 실험을 수행하고 결과에 따라 caspase-3 단백질의 활성도를 정상대조군에 비교하여 %로 표 시하였다.

세포사멸비율 측정은 annexin V-FITC apoptosis detection kit (Enzo Life Sciences Inc., Farthingale, NY, USA)를 사 용했다. HCT-116 세포에 노루오줌 에탄올 추출물 처리 후 유 도되는 apoptosis 및 necrosis의 비율을 구하기 위해 제조사에 서 제공한 protocol에 따라 annexin V-FITC와 PI 시약으로 염색했으며, 염색된 세포는 CytoFLEX (Beckman Coulter Inc., Brea, CA, USA)를 이용해 분석하였다.

세포 내부에 활성산소종의 비율 측정은 DCFDA cellular ROS detection assay kit (Abcam, Cambridge, England)를 사 용했다. 세포에 H₂O₂ 처리에 따른 활성산소종의 생성을 확인하 기 위해 DCFDA (2’7’-dichlorofluorescin diacetate, H₂DCFDA) 시약으로 염색하였으며, 염색된 세포는 CytoFLEX (Beckman Coulter Inc., Brea, CA, USA)를 이용해 분석하였다.

TUNEL 염색은 DeadEnd™ Fluorometric TUNEL System (Promega Co., Madison, WI, USA)을 이용하였으며, 제조사 에서 제공된 프로토콜에 따라서 수행하였다.

HCT-116 세포를 12 well plate에서 cover slip 위에 5 × 10⁵ cells/㎖ 농도가 되도록 분주한 뒤, 37℃, 5% 배양기에서 24 시간 배양했다. 배양된 세포는 500㎍/㎖ 농도로 노루오줌 에탄올 추출물을 24 시간 동안 처리하였다. 그 후 10% NBF (neutralized buffered formalin)로 4℃에서 30 분 동안 고정하 였고, 차가운 PBS (phosphate buffered saline)로 2 번 씻어 주었다. 다음으로 0.2% Triton X-100 in PBS 용액으로 10 분간 투과화 한 뒤 차가운 PBS로 2 번 씻어주었다. 티슈를 이용해 남은 액체가 없도록 모두 제거하고 키트에서 제공된 equilibration buffer를 5 분간 처리하였으며 100㎕ rTdT incubation buffer를 처리하고 37℃에서 60 분 동안 배양하 였다. 그 후 제공된 2 × SSC buffer를 10 분간 처리하고, PBS 로 2 번 씻은 뒤 Prolong™ Gold Antifade Mountant with DAPI (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Massachusetts, USA)로 세포를 마운트하여 epi-fluorescence microscope (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)하에 관찰하였고 DAPI와 TUNEL의 형광을 각각 알맞은 파장에서 촬영하였다.

통계처리는 평균 ±표준편차 (Means ± SD)로 표시하였고, 처 리군 간 유의성을 검정하기 위해 SPSS (Statistical Package for Social Science Inc., Chicago, IL, USA) 통계 프로그램을 사용하였다. 일원변량분석 (One-way ANOVA)을 실시하여, 유 의성이 있는 경우 p < 0.05 수준에서, Duncan’s Multiple Range Test (DMRT)와 Tukey post-hoc test를 실시하였다.

노루오줌 [Astilbe chinensis (Maxim.) Franch. Et Savat.] 에탄올 추출물이 대장암세포주인 HCT-116 세포에 대해 성장 억제효과를 나타내는지 알아보기 위해 MTS assay를 진행하였 다. HCT-116 세포에 노루오줌 에탄올 추출물을 다양한 농도 (31.3, 62.5, 125, 250, 500㎍/㎖)로 24 시간 동안 처리하였 을 때 500㎍/㎖에서 세포생존율이 38.96 ± 1.32%로 감소되었다 (Fig. 1A).

Fig. 1  ARE increased caspase-3 protein activation and DNA fragmentation in HCT-116 cells.

(A) HCT- 116 cells were treated with ARE for various concentration. Cell viability was measured by MTS assay, (B) caspase-3 activation was measured by caspase-3 activity assay, (C) HCT-116 cells treated with 500㎍/㎖ ARE, TUENL fluorescence analyzed by TUNEL assay. *Different letters are significantly different at p< 0.05 by Duncan's Multiple Range Test (DMRT). Representative images were taken from at least three independent experiments.

Caspase-3 단백질은 다양한 암세포에서 세포사멸에 관여한다 고 알려진 단백질들 중 하나로 알려져 있다 (O’donovan et al., 2003; Choi, 2007). 이에 따라 HCT-116 세포에서 caspase-3 단 백질 활성도를 확인해본 결과 500㎍/㎖ 노루오줌 에탄올 추 출물 처리에 의해 정상대조군 (100%) 대비 133.08 ± 3.41% 로 증가되었다 (Fig. 1B). 125㎍/㎖ 농도 처리군은 10⁸.97 ± 1.81%, 250㎍/㎖ 농도 처리군은 117.69 ± 3.84%로 처리량이 높아질수록 caspase-3 단백질 활성도가 증가하였다.

이는 MTS assay 결과와 비교하였을 때, 500㎍/㎖ 농도에 서 HCT-116 세포의 생존율을 38.96 ± 1.32% 까지 감소시킨 것과 비교해 caspase-3 단백질 활성도는 처리농도대비 큰 차 이가 나타나지 않아, caspase-3 단백질뿐만 아니라 암세포 사 멸에 관련하는 여러 단백질들인 BAX (Bcl-2-associated X protein), BID (BH3 interacting-domain death agonist) 및 XIAP (X-linked inhibitor of apoptosis protein)을 추가적으로 확인해야 할 것으로 사료된다.

다음으로 노루오줌 에탄올 추출물이 대장암세포에 대해 apoptosis 또는 necrosis를 일으키는지 알아보기 위해, HCT- 116 세포주에 가장 효과가 좋게 나타났던 500㎍/㎖ 농도로 24 시간 동안 처리하고 TUNEL 염색을 실시한 결과, 노루오 줌 에탄올 추출물 처리군에서 TUNEL 형광이 증가되는 것을 확인하였다 (Fig. 1C).

TUNEL 은 apoptosis의 특징중 하나인 DNA 단편화를 시 각화하는 방법으로 알려져 있으며 (Kyrylkova et al., 2012), 이에 근거하여 노루오줌 에탄올 추출물은 HCT-116 세포주에 대해 apoptosis를 일으켜 암세포를 사멸시키는 것으로 보인다. 다음으로 annexin V and propidium iodide (PI) 염색을 통해 유세포분석기를 이용하여 apoptosis의 비율을 확인한 결과 500㎍/㎖ 추출물은 early apoptosis (Q2-4)를 34.56 ± 1.67% 까지 증가시키는 것으로 나타났다 (Fig. 2A and 2B).

Fig. 2  ARE increased early apoptosis in HCT-116 cells.

(A) early apoptosis ratio was measured by annexin V and PI staining. Data represent the means ± SD (n = 3). *Different letters are significantly different at p < 0.05 by Tukey posthoc test. Representative images were taken from at least three independent experiments.

노루오줌 에탄올 추출물을 500 ㎍/㎖ 농도로 처리하였을 때 late apoptosis (Q2-2)가 2.10 ± 0.53%로 정상대조군의 late apoptosis (Q2-2)가 1.34 ± 0.46%인 것을 비교하였을 때 증가 폭의 차이가 크게 없는 것으로 보아 노루오줌 에탄올 추출물 은 apoptosis 과정 중 early apoptosis를 촉진시키는 것으로 사료된다.

노루오줌 에탄올 추출물이 마우스 대식세포인 세포에서 자 체적인 세포독성을 가지는지 또는 산화스트레스를 통해 세포 사멸을 유도하는 H₂O₂처리에 대한 추출물의 세포보호효과를 확인하기 위해 MTS assay를 수행하였다.

세포에 노루오줌 에탄올 추출물을 다양한 농도 (31.3, 62.5, 125, 250, 500㎍/㎖)로 24 시간 동안 처리하였을 때 최고농 도인 500㎍/㎖에서 세포생존율은 90.70 ± 1.27%으로 정산대 조군에 비해 유의적인 차이가 있었으나 세포에 직접적으로 영 향을 미칠 정도의 세포독성은 나타나지 않았다 (Fig. 3A). 이 어서 추출물을 125, 250 and 500㎍/㎖의 농도로 30 분 동 안 전 처리한 뒤, 500 μM H₂O₂를 24 시간 동안 처리했을 때, H₂O₂ 처리군은 정상대조군과 비교하여 세포생존율이 64.81 ± 4.84%로 낮아진 반면 노루오줌 에탄올 추출물 처리군은 세 포생존율 (125㎍/㎖ 농도에서 75.96 ± 5.12%, 250㎍/㎖ 농 도에서 78.16 ± 4.95%, 500㎍/㎖ 농도에서 84.78 ± 3.5%)이 회복되었다 (Fig. 3B).

Fig. 3  ARE prevents H₂O₂-induced cell death and ROS production in RAW264.7 cells.

(A) RAW264.7 cells were treated with ARE for various concentration, (B) After pretreatment with ARE for various concentration, RAW264.7 cells were treated with 500 μM H₂O₂ for 24 h. Cell viability was measured by MTS assay. *Different letters are significantly different at p<0.05 by Duncan's Multiple Range Test (DMRT). Representative images were taken from at least three independent experiments.

H₂O₂ 처리에 대한 노루오줌 에탄올 추출물의 세포보호효과 는 125㎍/㎖와 250㎍/㎖의 농도에서 큰 차이가 나타나지 않 았지만 500㎍/㎖ 농도에서 세포보호효과가 크게 상승하였으 며, 이는 500㎍/㎖ 이상의 농도부터 세포보호효과가 급격히 증가될 것으로 예상된다.

다음으로 DCFDA 염색을 통해 H₂O₂ 처리에 의해 증가되는 ROS에 대한 노루오줌 에탄올 추출물의 ROS 억제율을 평균 치로 확인했을 때, 500 μM H₂O₂ 단독처리군은 정상대조군에 비해 97.50 ± 3.11%가 증가되었지만 이는 500㎍/㎖ 노루오줌 에탄올 추출물 처리에 의해 27.11 ± 5.01% 까지 감소되었다 (Fig. 4A and 4B).

Fig. 4  ARE prevents H₂O₂-induced cell death and ROS production in RAW264.7 cells.

(A and B) After pretreatment with ARE for various concentration, ROS production was measured by DCFDA staining using flowcytometry. Data represent the means ± SD (n = 3). *Different letters are significantly different at p < 0.05 by Duncan's Multiple Range Test (DMRT). Representative images were taken from at least three independent experiments.

DCFDA는 세포내부에서 생성된 ROS를 측정할 수 있는 방 법 중 하나로 산화스트레스 관련 실험 중 자주 사용되는 물질 이다 (Eruslanov and Kusmartsev, 2010). 여러 연구에 따르면 ROS는 다양한 질병과 염증반응에서 매개인자로 작용하는 원인 으로 알려져 있음에 따라 (Brieger et al., 2012; Hsieh et al., 2014), 노루오줌 에탄올 추출물이 항산화기능을 가지는 인자로 서 작용하는 가능성이 있는 것으로 생각되지만 이는 항산화 관 련 신호전달에 관여하는 superoxide dismutase, peroxidase, catalase 및 glutathione-S-trasferase의 항산화단백질의 활성 및 단백질 발현량을 증가시키는지 또는 노루오줌 에탄올 추출물에 존재하는 여러 성분들이 retinol, ascorbic acid, α-tocopherol 같 은 항산화제처럼 직접 작용하는지에 대한 추가 실험이 필요하 다고 생각된다. 또한 한의학에서 노루오줌은 풍열 (風熱)을 감 수하여 발생한 감기를 개선하는 풍열감모 (風熱感冒)의 효능 및 기침을 개선해주는 해수 (咳嗽)작용을 하는 것으로 알려져 있는데 (Kim, 1984; Oh et al., 1992), 실험 결과에서 노루오 줌 추출물이 대식세포의 산화스트레스 및 염증반응 매개 인자 인 ROS를 억제하는 작용을 나타냄에 따라, 염증반응에 일부 분 관여하는 것으로 생각된다.