밤나무 근권토양으로부터 균을 분리하기 위하여 충남 공주 5 개 지역의 밤나무 포장에서 각각 20 개씩, 총 100 개의 토 양시료를 채집하였다. 이들을 nested PCR (first round; ITS 1, 4 primer set, second round; dest 1, 4 primer set) 방법 을 이용한 PCR 분석으로 토양 내 인삼뿌리썩음병균 (C. destructans)의 존재를 확인하였다.

PCR 검출을 통해 병원균의 존재가 확인된 토양으로부터 균 주를 분리하기 위하여 토양 시료 1,000 배 희석액 100㎕를 반선택배지 [czapek solution agar 49 g, pentachloronitrobenzene (PCNB) 0.5 g, difenoconazol 2㎎, chloramphenicol 0.2 g, azoxystrobin 1㎎)에 도말을 하였고, 암조건하에서 15℃, 21 일 간 보관하였다. 그 후 배지에 유도된 colony 중 형태학적으로 인삼뿌리썩음병균과 유사한 균사를 potato dextorse agar (Difco Laboratories Inc., Detroit, MI, USA)에 각각 단균사 를 떼어 재분리하였으며, 추후 정확한 종 동정을 위해 DNA 를 분리하여 histone h3 영역의 염기서열 분석에 사용하였다.

밤나무 근권토양에서 분리된 I. radicicola 균주는 인삼 (Panax ginseng C. A. Meyer)에 대한 병원성 유무 및 그 차 이를 알아보기 위하여 묘삼을 이용하여 병원성 검정를 실시하 였다.

PDA 배지에 분리된 I. radicicola 균주를 14 일간 20℃에 서 배양하였으며, 배양된 균사는 40㎖의 멸균수를 넣고 마쇄 하여 현탁액을 만든 다음, 묘삼을 배양현탁액에 침지시킨 후 예정지 관리를 한 충남 금산에 위치한 인삼약초연구소에서 묘 삼을 이식하고 그 병원성 정도를 확인하였다.

또한 인삼에서 분리된 I. mors-panacis CY8005 균주와 I. cyclaminicola CY8073 균주를 대조균주로 사용하여 병원성의 차이를 확인하였다.

밤나무 근권토양에서 얻은 C. destructans 균주들의 genomic DNA 분리를 위해 PDA 배지에 분주하여 20℃, 암 조건에서 정치 배양하였다.

균사를 수확하여 동결건조시켜 마쇄한 후, proteinase K (50㎕)와 extraction buffer [200 mM NaCl, 30 mM EDTA, 200 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.5% SDS]를 넣고, 2 × CTAB solution [2% CTAB, 100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1% PVP, 1.4M NaCl, 20 mM EDTA]를 첨가하였다. 그 후 chloroform isopropanol (24 : 1)을 700㎕를 첨가하여 15 분 동안 13,000 rpm으로 원심분리하였다. 원심분리에 의해 얻어 진 상등액 1.5㎖를 tube에 넣고, 70% ethanol 700㎕로 세 척한 다음 13,000 rpm으로 15 분 동안 원심분리를 하였으며, 침전된 DNA를 제외한 나머지 물질들을 제거하였다. 실온에 서 ethanol이 완벽히 제거될 때까지 건조시키고 멸균증류수 50㎕를 넣고 다음 실험까지 −70℃에 보관하였다 (Doyle, 1990).

밤나무 근권토양 분리균과 인삼에서 분리된 CY8005, CY8014, CY8073 균주의 histone h3 영역을 PCR 증폭을 위 하여 제작된 CYLH3F와 CYLH3R primer를 이용하여 PCR 을 수행하였다 (Crous et al., 2004).

증폭된 PCR 산물은 Macrogen (Daejeon, Korea)에 염기서 열 분석을 의뢰한 후, 미국 국립생물정보센터 (NCBI)의 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)를 이용하여 NCBI에 등록된 병원균의 염기서열과 비교하였다.

또한 유연관계 분석을 위한 염기서열은 MEGA 6 program (Tamura et al., 2013)을 이용하여 alignment를 실시하여 일치 하지 않은 염기서열은 분석에서 제외하였다. 1,000 회의 bootstrap 분석을 통해 신뢰도를 평가하였으며, 새롭게 종이 분 류된 I. radicicola species complex를 대조균주의 DNA 염기 서열로 사용하였다 (Cabral et al., 2012).

공주 5 곳의 밤나무 포장으로부터 각각 20 개의 밤나무 근 권토양 시료를 채집하여 Ilyonectria radicicola가 존재하는 토 양을 선발하고 병원균을 얻기 위하여 nested PCR 방법을 활 용해 PCR 검정을 수행하였다 (Fig. 1).

Fig. 1  PCR detection of Ilyonectria radicicola from rhizospere soil of chestnut tree using nested PCR with dest 1, 4 primer set.

A; Gongju Suksongli, B; Gongju Nechonli, C; Gongju Jangwonli, D; Gongju Daesanli, E; Gongju Nemoonli, M; 100 bp ladder, P; positive control, N; negative control, lane 1 - 20; DNA isolated from rhizosphere soil of each chestnut tree.

Hamelin 등 (1996)은 소나무 유묘에서 Cylindrocarpon destructans의 존재여부를 판단하기 위하여 internal transcribed spacer (ITS) 영역으로부터 399 - 400 bp의 증폭산물을 나타내 는 primer set를 디자인하여 외부는 ITS 1, 4 primer set로 증폭시키고, 이 증폭산물을 dest 1, 4 primer set로 인삼뿌리 썩음병균을 검출할 수 있는 nested PCR법을 실시한 바 있다.

Jang (2005)은 이들 마커를 활용하여 인삼재배 예정지의 토 양으로부터 인삼뿌리썩음병균의 존재를 판단하는 시스템을 개발한 바 있다. 5 지역 밤나무 포장의 모든 곳에서 I. radicicola의 존재가 확인되었으며, 100 개의 토양시료 중 35 개의 토양시료에서 400 bp의 증폭산물을 나타내는 병원균의 존재를 확인할 수 있었다.

Jun (2009)은 밤나무 뿌리의 썩은 부위와 근권토양으로부터 C. destructans를 검출해 밤나무가 인삼뿌리썩음병을 일으키는 C. destructans의 기주일 가능성을 확인하는데 이번 실험을 통 해 그 점을 확실하게 밝혀내었다.

밤나무 근권토양에서 I. radicicola의 존재를 확인한 토양으 로부터 반선택배지를 이용하여 균 분리를 하였으며 (chestnut 7, 11, 12, 17, 18 and 24), histone h3 영역의 유연관계분석 을 실시하여 종 동정을 실시하였다 (Fig. 2.)

Fig. 2  Phylogenetic analysis of Ilyonectria radicicola species complex obtained from chestnut tree rhizosphere soils using histone h3 sequence region.

The unidentified isolates of chestnut rhizosphere soils were in the same group as the existing ginseng isolate I. radicicola complex. The bootstrap analysis was performed with 1,000 replications.

Seifert 등 (2001)은 ITS 영역의 염기서열을 이용해 C. destructans complex 내에 한국, 일본 및 미국의 인삼분리균만 을 포함하는 그룹과 다른 기주들로부터 분리된 그룹으로 나누 었으며, Seo (2009)는 국내 인삼으로부터 분리한 C. destructans 의 ITS 염기서열 분석을 통해 인삼 분리균을 포함하는 그룹 이외에도 다른 기주에서 분리된 C. destructans와 한 그룹을 이루는 균들을 확인하였다.

최근에는 새로운 분류체계에 의해 I. mors-panacis, I. robusta, I. panacis와 I. crassa 등 4 종이 인삼으로부터 분리 된 종으로 확인된 바 있다 (Cabral et al., 2012). 또한 국내 에서는 인삼뿌리썩음병균의 재분류를 통해 I. mors-panacis, I. robusta, I. liriodendri, I. cyclaminicola와 두 그룹의 미동정 종을 보고하였다 (Seo, 2017).

밤나무 근권토양으로부터 분리된 균들은 모두 새로운 분류 체계에 의해 I. radicicola complex 내에 모두 포함되었으며, 시클라멘에서 분리한 I. cyclaminicola와 가장 근연의 종을 이 루었다.

Seo (2017)는 인삼분리균 중 I. cyclaminicola를 분리한 바 있으며, 이들로부터 병원성을 확인하였다. 또한 밤나무 근권토 양에서 분리된 균주가 인삼에서 분리된 CY8014와 유전적으 로 일치하는 것으로 보아 밤나무 또는 밤나무 근권토양에서 존재하는 병원균이 인삼밭으로 유입하여 인삼에 뿌리썩음병을 일으킬 수 있는 가능성을 보여주었다.

포장검정을 통해 밤나무 근권토양으로부터 분리된 I. radicicola 균이 인삼에 직접 침입하여 병을 일으키는 것을 확 인하였다 (Fig. 3 and 4, Table 1).

Fig. 3  Pathogenicity on ginseng roots by chestnut 11 isolate from chestnut rhizosphere soil.

4 Weeks (a), 6 weeks (b), 8 weeks (c) and 12 weeks (d) after inoculation, respectively.

Fig. 4  Optical images showing symptoms of root rot due to Ilyonectria radicicola affected by highly (a) and Weakly (b, c and d) aggressive I. radicicola isolates in vivo on field cultivating ginseng roots.

Ginseng roots were inoculated by CY8005 (a, 6 weeks), CY8073 (b, 3 years), chestnut 11 (c. 3 years) and chestnut 24 isolate (d, 3 years) after inoculation.

인삼에 대하여 강병원성 균으로 알려진 I. mors-panacis로 동정이 된 CY8005 균주의 경우에는 병 접종 6 주 후, 발병 도가 100%로 모두 썩은 반면 밤나무 근권토양에서 분리된 병 원균들은 접종 초기에는 CY8005에 비하여 병의 진전은 없었 지만, 시간이 지남에 따라 인삼에 약하게 뿌리썩음병을 일으 켰다. 또한 인삼에 대하여 약병원성인 I. cyclamicicola로 분류 된 CY8073과 비교하였을 때 초기 병 진전속도는 느리지만, 병 접종 3 년 후에 인삼에 병을 야기하는 것을 확인하였다.

국내 작약에서 분리한 I. robusta가 인삼에 뿌리썩음병을 일 으킨다는 보고가 있다 (Seo et al., 2017). 이는 기존 인삼에 서 분리된 I. mors-panacis, I. panacis, I. robusta, I. crassa 등 4 종 중 하나로 인삼에 뿌리썩음병을 일으킬 수 있는 가 능성이 컸지만, 이번 밤나무 근권으로부터 분리된 균 (I. radicicola complex)은 지금까지 보고된 인삼 병원균이 아님에 도 인삼에 뿌리썩음병을 일으키는 것을 확인하였다.

이에 따라 인삼 재배지 선정 시, 기존에 보고된 인삼, 작약, 딸기 이외에 밤나무 재배지도 회피하여 인삼뿌리썩음병을 예 방할 필요가 있다고 판단된다.