국내 인삼 (Panax ginseng C. A. Meyer)재배지의 뿌리썩음병 발병현황을 조사하기 위하여 2020년 6년근 인삼 수확포장 중 충청남도, 충청북도, 경기도, 강원도, 전라북도를 대상으로 과거에 인삼을 한번도 재배하지 않은 초작지 27 개 포장을 조사하였다.

포장 당 90 ㎝ × 180 ㎝ (1 칸)을 기준으로 포장 당 3 반복 이상을 조사면적으로 선정하였으며, 뿌리썩음병 병반 정도에 따라 5 단계로 나누어 조사를 실시하였다. 병반 면적에 따라 0% (무발병) = 0, 1% - 30% = 1, 31% - 60% = 2, 61% - 99% = 3, 100% (결주 혹은 완전부패) = 4로 각각 구분하였다. 발병지수 (disease severity index, DSI)는 다음과 같이 환산하였다.

DSI = [이병개체수 × (이병도 합/총 개체수)]/총 개체수

이병도 합은 각 단계별 뿌리썩음병 발생등급에 해당하는 발병주수를 곱한 후 (발병등급 × 발병주수) 총 합을 계산하였다.

6 년근 인삼의 재배지에서 뿌리썩음병 발병현황을 조사한 지점의 토양을 채취하여 분석에 사용하였다. 증류수 750 ㎖에 acetic acid 11.5 ㎖ + 1 N ammonium chlroride 10.70 g + ammonium fluoride 0.56 g을 녹인 후 hydrochloric acid 1 ㎖를 첨가하여, 1,000 ㎖가 되도록 증류수를 채우고 토양 3 g을 삼각플라스크에 평량하여 침출액 25 ㎖를 가한 후 5 분간 진탕하여 Whatman No.2 여과지로 여과하여 각각의 성분 분석에 이용하였다.

토양화학성은 농촌진흥청 토양화학분석법에 준하여 p H, EC, 유기물, 인산 및 치환성 양이온 (K, Ca, Mg, Na)에 대하여 분석하였다 (NIAST, 2000).

인삼 뿌리썩음병 발병조사를 실시한 6 년근 인삼 수확지에서 뿌리썩음병 증상을 보인 인삼을 채집하였고, 병반으로부터 병원균을 분리하였다.

채집된 인삼을 세척 후, 병반 조직을 0.5 ㎝ 크기로 절단하고, 1 분간 1% NaOCl에 침지하여 표면소독을 실시하였다. 소독이 완료된 이병조직은 potato dextrose agar (PDA, Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA) 배지에 치상하고, 15℃ - 20℃에서 7 일간 암조건에서 배양하였다. 배양된 조직으로부터 순수분리된 균주들은 PDA 배지에 재배양 하였다. 배양된 균주는 20℃에 보관하여 실험에 사용하였으며, 일부는 20% glycerol을 이용하여 –70℃에 보관하였다.

순수분리된 균주들은 genomic DNA를 추출하기 위해 PDA 배지로부터 균사를 수거하여 1.5 ㎖ effendorf tube에 넣어 동결건조를 하였다.

동결건조된 균사는 400 ㎕의 extraction buffer (200 mM Tris-HCl (pH8.0), 200mM NaCl, 3 0mM EDTA (ethylenediamine-tetraacetic acid), 0.5% SDS (sodium dodecyl sulfate)를 섞고 마쇄한 후, 700 ㎕의 chloroform : isopropanol (24 : 1)을 첨가하여 15 분 동안 13,000 rpm으로 원심분리하였다. 분리된 상층액은 100% ethanol 800 ㎕를 첨가하여 10 분간 13,000 rpm으로 원심분리하여 genomic DNA를 침전시켰다. 상층액 제거 후, 세척을 위해 70% ethanol 800 ㎕를 첨가하고 13,000 rpm으로 5 분간 원심분리하여 DNA를 제외한 이물질들을 제거하였다. 침전된 DNA는 ethanol을 제거하고 멸균수 50 ㎕를 넣고, 추후 실험에 사용하기 위해 냉동보관 하였다 (Doyle, 1990).

인삼 이병부위에서 분리된 병원균의 유전학적 동정을 위하여 internal transcribed spacer (ITS) 영역을 증폭하였다.

본 연구에서 사용한 primer는 ㈜제노텍 (Daejeon, Korea)에서 제작하였으며, PCR 반응을 위해 총량 20 ㎕ 반응액에 10 ng의 주형 DNA, 1 X PCR buffer, 각각의 dNTP 0.2 mM, 각 primer 10.0 mM, 1 U taq ploymerase 0.2 ㎕를 첨가하였다. ITS 1과 I TS 4 p rimer를 이용한 PCR 증폭은 94℃, 30 초 55℃, 30 초 72℃, 30 초 조건으로 35 cycle로 수행하였다 (White et al., 1990). 전기영동을 통해 약 520 bp의 PCR 산물을 확인한 후 direct sequencing 방법을 통해 염기서열을 확인하였다.

획득한 염기서열은 MEGA6 프로그램 (Tamura et al., 2013)을 사용하여 불일치한 염기서열은 제외하였으며, 1,000회의 bootstrap 분석을 통하여 신뢰도를 평가하였다. 증폭된 ITS 유전자들의 염기서열은 NCBI (The National Center for Biotechnology Information, USA)에 이미 기탁되어 있는 해당 종의 ITS 유전자와 99.0% - 100.0% 수준에서 상동성을 보였다.

국내 6 년근 인삼 (Panax ginseng C. A. Meyer) 수확지 27 농가를 대상으로 인삼뿌리썩음병의 발병현황을 조사하였다. 각 농가당 90 ㎝ × 180 ㎝를 기준으로, 3 반복 이상에 대하여 인삼뿌리의 썩음 정도에 따라 이병도를 구한 후 DSI를 산출하였다.

충북 농가들의 발병지수는 0.79 - 2.38 (평균: 1.45)로 나타났으며, 충남은 1.11 - 2.85 (평균: 1.75), 강원 0.51 – 2.92 (평균: 2.23), 경기 0.04 - 2.24 (평균: 1.32), 전북 0.51 - 1.71 (평균: 1.08)로 확인되었다. 발병지수가 1.0 이하인 곳은 총 7 포장 (안성 1, 안성 2, 충주 1, 충주 2, 춘천 2, 해남 1, 나주 1)이었으며, 1.0 - 2.0인 곳은 11 개 포장으로 가장 많았다. 그리고 9 개의 농가 (안성 3, 청주 2, 춘천 1, 괴산 1, 홍성 1, 홍천 1 - 4)에서 2.0 - 3.0의 발병지수가 나타났으며, 조사한 27 포장 중 홍천 1은 2.92로 발병지수가 가장 높았다 (Table 1).

인삼은 이식삼의 경우, 관행적으로 90 ㎝ × 180 ㎝ 기준으로 약 63 - 72 주의 묘삼 (1 년근)을 식재하여 5 년간 재배하면서 뿌리썩음병 등 각종 병해와 환경에 의해 결주가 발생하게 된다. 조사한 인삼 포장의 평균 결주율은 41.8%로 확인되었으며, 발병지수에 따라 1.0 이하인 포장은 평균 23.0%의 결주율을 보였다. 발병지수가 1.0 - 2.0인 포장은 43.7%, 발병지수가 2.0 - 3.0 포장의 평균 결주율은 54.5%로 나타났으며, 뿌리썩음병의 발병지수에 따라 결주율이 크게 증가하는 것이 확인되었다. 국내 연구진의 결과에서도 인삼 재배시 약 45.0% - 50.0% 이상이 뿌리썩음병에 의한 결주가 발생된다고 보고되었다 (Chung, 1972; Seo et al., 2019), 이상의 결과로 연작장해의 주요 원인인 뿌리썩음병은 초작지에서도 병 발생이 만연하다는 것을 확인되었다.

국내 6 년근 인삼 재배지 27 농가에 대한 토양화학성에 대한 분석을 통하여 뿌리썩음병과의 관련성을 알아보았다 (Table 2).

토양산도 (pH)의 허용범위는 6.0 - 6.5로 8 개 농가만이 허용범위 안에 있었으며, pH 6.0 이하는 17 개 농가로 가장 많은 재배지들이 이에 해당이 되었다. 그리고 전기전도도를 통한 염류농도는 0.5 - 1.0 dS/m가 인삼을 재배하기 위한 허용범위로 오직 4 개 농가에서만 범위 안에 있었으며, 그 외 25개 농가에서는 모두 1 dS/m 이상이었다.

염류농도가 높아지면 이에 의해 뿌리에 상처가 나기 때문에 뿌리썩음병 발생이 증가하게 된다 (Yang et al., 2000). 인삼의 연작장해에 의한 인삼뿌리썩음병은 토양 병원균에 의한 결주가 가장 큰 원인이며 (Rahman and Punja, 2005), 연작장해 유발토양은 억제토양에 비하여 토양산도와 염류농도가 높게 나타났다. (Lee et al., 20210). 따라서 인삼뿌리썩음병원균이 검출이 되지 않은 홍천 1과 홍천 3 농가는 발병지수가 높았지만, 뿌리썩음병원균의 주된 병원균인 I. radicicola나 F. solani가 아닌 부수적인 F. oxysporum에 의하여 (Lee, 2004), 뿌리썩음병원균이 토양 이화학성화학성과 같은 환경요인으로 인해 발생한 것으로 보인다.

인삼뿌리썩음병에 대한 발병지수가 2.0 이상의 9 농가 중에서 토양산도는 홍천 3, 안성 3을 제외한 모든 재배지에서 pH 6.0보다 낮은 것을 확인하였으며, 전기전도도를 통한 염류농도의 경우에는 모든 농가가 1 dS/m 이상이었다.

인삼 6 년근 수확지에서 뿌리썩음병이 발생된 인삼을 채집하여 PDA 배지에서 균을 분리하고, 이들 중 일부의 병원균을 동정하고 분리 비율을 확인하였다 (Fig. 1). 총 587 균주를 병반에서 분리하여, 균학적 특성 중 형태적으로 유사한 병원균들은 제외하고, 그 중 138 균주에 대하여 ITS 영역을 이용하여 병원균을 동정하였다. 염기서열 분석 결과, 뿌리썩음병 관련 균주인 Ilyonectria radicicola (44 균주), Fusarium solani (45 균주)는 각각 31.9%, 32.6%의 비율로 균이 동정되었다 (Table 3).

Fig. 1.  The ginseng with root rot and isolation of colony using PDA media.

Ginseng root rot (A), isolation of pathogens from lesions (B).

강원도의 홍천 포장들 (홍천 1, 홍천 2, 홍천 3, 홍천 4)은 Table 4에서 보는 바와 같이 인삼뿌리썩음병의 주된 원인균인 I. radicicola가 병반에서 분리가 되지 않았음에도 불구하고 이병도가 2 이상인 것을 확인할 수 있었으며, 충주 1, 충주 2, 안성 1, 안성 2, 나주 1의 경우에는 이병도가 1 이하로 나타났지만, I. radicicola 균주가 분리되는 것을 알 수 있었다.

홍천 1 - 4 포장은 주된 병원균인 I. radicicola는 분리되지 않았으나 F. solani와 같은 병원균에 대하여 인삼이 감수성이거나 환경이 병원균에 유리하고 인삼 생육에 영향을 주었기 때문에 이병도가 2 이상으로 나온 것으로 판단된다. 반대의 의미로 충주 1 - 2, 안성 1 - 2, 나주 1 포장은 I. radicicola가 인삼 병반에서 분리가 되어 충분히 인삼뿌리썩음병을 일으킬 수 있겠지만, 기주인 인삼이 병원균에 저항성이었거나 재배환경이 병원균이 병을 일으키는데 제약을 준 것으로 생각된다.

인삼 수확지로부터 6 년근 인삼 병반에서 병원균을 분리하였고, 이들의 ITS 영역의 염기서열을 통하여 종 동정을 실시하였다.

국내에 보고된 인삼뿌리썩음병의 주된 원인균인 I. radicicola 그룹은 인삼에 대하여 강병원성을 보이는 I. morspanacis와 약병원성인 I. cyclaminicola, I. venezuelensis, I. robusta, I. liriodendri가 보고되었다 (Seo, 2017).

2020년 수집 균주 41 균주 중에서 I. mors-panacis, I. cyclaminicola와 같은 그룹에 속한 균주는 21 균주가 확인되었으며, I. liriodendri와 같은 그룹은 3 균주, I. venezuelensis와 같은 그룹은 7 균주, I. robusta와 같은 그룹은 10 균주로 동정되었다 (Fig. 2).

Fig. 2.  Phylogenetic analysis of Ilyonectria radicicola complex isolated from root rot of 6 years old ginseng using ITS region.

The bootstrap analysis was performed with 1,000 replications. Bold bar is I. radicicola complex.

현재까지 인삼에서만 기주로 알려진 I. mors-panacis와 시클라멘이 기주인 I. cyclaminicola 그룹의 경우에는 다양한 종들이 그룹을 이루기 때문에 새로운 유전자로 유연관계 분석을 실시하여 정확한 종 동정이 필요하다. I. liriodendri는 주로 유럽종 포도에 대하여 검은뿌리썩음병을 일으키는 것으로 알려져 있으며, I. robusta는 참나무, 미국삼, 체리, 포도나무 등의 기주로 보고되었다 (Cabral et al., 2012; Seo et al., 2018). 국내에서는 밤나무, 포도나무, 소나무에서 병원균을 분리하여 I. cyclaminicola, I. liriodendri 병원균을 얻었으며, 인삼에 대한 감염률이 30.2% - 37.5%를 보인 것을 확인하였다 (Seo, 2017).

또한 6 년근 수확포장에서 분리한 F. solani는 크게 두 그룹으로 나뉘었다 (Fig. 3). 인삼 (F. solani f. sp. pisi)과 곤약 (F. solani f. sp. radicicola)에서 분리된 그룹과 인삼, 완두콩, 뽕나무 (F. solani f. sp. pisi)와 아카시아 (F. solani f. sp. robiniae)에서 분리한 그룹으로 약 5 (36 균주) : 1 (7 균주)의 비율로 나뉘어지는 것을 확인하였다.

Fig. 3.  Phylogenetic analysis of Fusarium solani from root rot of 6 years old ginseng using ITS region.

The bootstrap analysis was performed with 1,000 replications. Bold bar is F. solani group.

유연관계 분석을 통하여 인삼에 뿌리썩음병을 일으키는 주요 병원균인 I. radicicola와 F. solani는 다양한 기주와 관련이 있는 것을 확인하였으며, 국내에도 다양한 기주에 이들 병원균이 존재할 것으로 생각되며, 추후 이들 기주탐색에 대한 연구가 필요할 것으로 보여진다.