경북 영양 재배지에서 수확한 일천궁 (C. officinale Makino) 괴경의 눈 부분을 적출하여 기내식물체 확립을 위한 재료로 사용하였다. 적출한 눈은 흐르는 물에서 이물질을 제거하고 70%의 EtOH을 이용하여 1 분동안 세척한 후, 2% NaOCl에서 20 분간 소독하였고 멸균수로 3 회 세척하여 신초 유도용 재료로 사용하였다.

신초 유도배지는 1/2 MS (Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands) 배지에 2% sucrose, 0.3% gelrite 그리고 200 ㎎/ℓ의 cefotaxim이 첨가된 페트리디쉬 (90 ㎜ × 10 ㎜, SPL Life Science Inc., Pocheon, Korea) 배지에서 수행하였다.

유도된 신초는 MS 배지에 3.0% sucrose와 0.3% gelrite가 포함된 유리 배양병 (10 ㎜ × 15 ㎜) 배지에서 6 개월 이상, 4 주 간격으로 계대 배양하였으며, 계대 배양 후 4 주가 경과된 기내식물체의 엽, 엽병 그리고 뿌리 절편을 체세포 배발생 유도를 위한 재료로 사용하였다. 배양환경은 25 ± 2℃, 광조건 (70 μmol·m^-2·s^-1 냉백색 형광등, 16 시간 조명)에서 배양하였다.

배발생 조직 유도를 위해 기내식물체의 엽 절편 (가로 0.3 ㎝ ×세로 0.3 ㎝)과 줄기와 뿌리 (0.5 ㎝ - 1.0 ㎝의 길이)를 절편체로 사용하였다.

배발생 조직 유도 배지는 MS 배지에 3.0% sucrose, 0.3% gelrite, pH 5.7 조건의 배지에 사이토키닌 benzylamino purine (BA), kinetin, Thidiazuron (TDZ)과 옥신 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), picloram을 각 0, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0 ㎎/ℓ의 농도별로 첨가 후 절편체를 배양하였다.

배양 8 주 후부터 배발생 조직이 유도되었으며 유도된 배발생 조직은 MS배지에 1.0 ㎎/ℓ의 2,4-D, 3.0% sucrose 그리고 0.3% gelrite가 첨가된 배지에서 증식하였다. 절편체는 페트리디쉬 당 8 개를 치상하였고 3 반복으로 실험을 진행하였다. 배양환경은 25 ± 1℃, 암배양 하에서 수행하였으며, 배양 8 주 후 절편당 및 호르몬 종류에 따른 배발생조직 및 체세포배 유도율과 체세포배 개수를 측정하였다.

발아 배지는 1/2 MS 배지에 3.0% sucrose, 0.3% gelrite 호르몬을 첨가하지 않은 배지를 사용하여 체세포배 발아를 유도하였다. 발아 배지는 페트리디쉬 (90 ㎜ × 10 ㎜, SPL Life Science Inc., Pocheon, Korea)를 사용하였고 배양 4 주마다 새로운 배지로 계대배양 하였다.

기내식물체 유도배지는 1/2 MS 배지에 2.0% sucrose, 0.3% gelrite가 첨가된 기본 배지를 사용하였으며, 배양 용기는 유리 배양병 (100 ㎜ × 150 ㎜)을 사용하여 기내식물체를 유도하였다. 모든 실험의 배양조건은 25±1℃의 광조건 (70 μmol·m^-2·s^-1 냉백색 형광등, 16 시간 조명) 하에서 배양하였다. 배양 4 주 이후 기내 재분화 식물체의 줄기길이, 엽수, 뿌리 길이, 뿌리 수, 뿌리 직경 및 비대근 유도율을 조사하였다.

동일한 엽 절편에서 유도된 체세포배를 하나의 라인으로 보고 체세포배 유도 및 발아가 우수한 4 개의 라인 중 식물체 길이가 7 ㎝ 이상의 건전한 개체를 각 40 개씩 선발하여 순화를 위한 재료로 사용하였다.

인공상토는 펄라이트와 버미큘라이트 2 종을 사용하였다. 상토의 배합비율은 펄라이트 단독 사용 그리고 펄라이트 : 버미큘라이트 (1 : 1 = v : v) 조합에 각각 20 개씩 식물체를 이식하여 순화하였다. 뿌리 부위의 배지는 흐르는 물에서 모두 제거한 후 순화를 위해 사용하였다.

순화 직후부터 90%의 공기 중 습도를 2 주간 유지하였으며, 2 주 이후 60%의 습도를 유지하며 순화하였다. 순화실은 25 ± 1℃, 70 μmol·m^-2·s^-1 냉백색 형광등, 16 시간 조명하에서 4 주간 생육 후 온실로 이동하여 30 일 뒤 생존율을 조사하였다.

통계분석은 SPSS 프로그램 (IBM SPSS Statistics, Ver. 25, IBM Co., Armonk, NY, USA)를 이용하여 ANOVA 분석을 하였으며 Duncan’s Mutiple Range Test (DMRT) 방법으로 5% 유의수준에서 통계적 유의성을 검정하였다 (p < 0.05). 체세포배 유도율은 평균치 (means)로 나타내었고, 절편 체당 체세포배수는 평균치 ± 표준편차 (means ± SD)로 나타내었다. 각 처리는 한 페트리디쉬당 8 개의 절편씩 치상하여 3 반복으로 진행하였다.

배발생 조직 유도율은 세 종류의 절편 중 엽 절편체에서 가장 높았다. 체세포배의 유도 형태는 사이토키닌이 첨가된 배지의 경우 절편에서 직접 체세포배가 유도되는 직접 체세포배 발생 (direct somatic embryogenesis) 형태로 나타났으며, 옥신 첨가 배지에서는 배발생 조직이 나타난 후 체세포배가 유도되는 간접 체세포배 발생 (indirect somatic embryogenesis) 형태가 특징적으로 나타났다.

엽 절편을 접종한 사이토키닌 처리 배지에서는 배발생조직 유도율은 0.5 ㎎/ℓ와 1.0 ㎎/ℓ 농도의 kinetin 처리에서 모두 95.8%로 높은 유도율을 보여주었으며, 다음으로 1.0 ㎎/ℓ의 수준의 BA 처리에서는 79.2%의 배발생 조직이 유도되었다 (Table 1). 0.5 ㎎/ℓ의 TDZ 처리에서는 20.0% 이하의 낮은 배발생 조직 유도율을 보여 배발생 조직 유도를 위해서는 적정하지 않았다 (Table 1).

엽 절편당 유도된 체세포배 개수는 0.5 ㎎/ℓ - 2.0 ㎎/ℓ의 BA 처리에서 절편당 평균 10 개에서 17 개까지 유도되었으며, kinetin의 경우 0.5 ㎎/ℓ의 농도에서 11.6 개, 2.0 ㎎/ℓ의 농도에서는 11.2 개 순으로 유도되었다.

TDZ첨가 배지에서는 0.5 ㎎/ℓ 처리에서 평균 5.2 개의 체세포배가 유도되었으며, 그 이상의 농도에서는 체세포배가 유도되지 않았다 (Table 1). 사이토키닌처리 배지에 접종한 대부분 엽절편에서는 배양 2 주 이후부터 직접 체세포배발생 형태로 체세포배가 유도되었으며, 배발생조직을 거치지 않고 초기 단계의 심장형, 어뢰형의 체세포배가 엽절편의 절단면을 따라 형성되었다 (Fig. 1A and B).

Fig. 1.  Somatic embryogenesis of C. officinale.

Leaf explants cultured on MS medium supplemented kinetin 2.0 ㎎/ℓ induced globular (A) and heart-shaped (B) direct somatic embryos after culture for 3-week (Bar = 1 ㎜). (C) Indirect embryogenic callus and globular - torpedo stage embryo induced from leaf explant on MS medium supplemented 2,4-D 0.5 ㎎/ℓ after culture for 10 weeks (Bar = 1 ㎜). (D) Germinated somatic embryos were developed from leaf explants on MS medium supplemented BAP 3.0 ㎎/ℓ after culture for 4 weeks. (E) Root formation on MS hormone free medium for 8 week. (F) Plantlets were transferred to different artificial soils and left to grow for 60 days.

옥신첨가 배지에 엽절편을 접종한 후 배발생 조직의 유도율은 0.5 ㎎/ℓ 수준의 2,4-D 처리에서 75%의 유도율과 절편당 평균 16.2 개의 체세포배 유도를 보여주었다. Picloram 처리의 경우, 0.5 ㎎/ℓ의 picloram 첨가 배지에서 20.8%의 배발생 조직 유도율을 보였으며, 1.0 ㎎/ℓ와 2.0 ㎎/ℓ 농도의 picloram 처리 배지에서 8.3%, 3.0 ㎎/ℓ의 picloram 처리에서는 배발생조직이 유도되지 않아 체세포배 발생 유도 배지로 적정하지 않았다 (Table 1). 옥신이 첨가된 배지에 접종한 엽 절편에서는 간접 체세포배 발생형태로 배양 4 주 이후 연노랑색을 띄는 배발생 조직이 유도된 후 체세포배가 함께 유도되었다 (Fig. 1C).

사이토키닌 첨가 배지에 엽병 절편을 접종한 결과 1.0 ㎎/ℓ의 kinetin 첨가 배지에서 45.8%의 배발생 조직이 유도되었다 (Table 2). 1.0 ㎎/ℓ - 3.0 ㎎/ℓ 농도 수준으로 첨가된 BA 첨가 배지에는 접종한 엽병 절편으로부터 약 25.0%에서 41.7% 수준으로 체세포배 발생이 유도되었으며, 절편당 유도된 체세포배의 수는 평균 12.8 개에서 28.2 개로 나타났다 (Table 2). 대부분의 체세포배는 직접 체세포배 발생형태로 유도되었고 배양 4 주 이후 어뢰형 체세포배 단계를 지나 부분적으로 발아가 되는 것이 관찰되었다.

엽병 절편을 대상으로하여 picloram과 2,4-D를 처리하는 경우, 배양 4 주 이후부터 연노랑 배발생 조직이 형성되었으며, 9 주 이후부터 체세포배가 형성되는 것이 관찰되었다. 체세포 배발생 유도율은 20% 미만이었으며, 절편당 체세포배유도 효율은 사이토키닌 처리와 비교하여 저조하였다 (Table 2).

뿌리 절편을 사이토키닌 첨가 배지에 접종한 결과 체세포배 발생은 1.0 ㎎/ℓ의 kinetin 처리에서 20.8%의 유도율을 보였으며, 절편당 유도된 체세포배의 개수는 평균 8.9 개로 나타났다. 옥신이 첨가된 배지에서는 0.5 ㎎/ℓ의 2,4-D 처리에서 29.2%의 배발생 조직이 유도되었고, 평균 9.3 개의 절편당 체세포배가 유도되었다 (Table 3). 뿌리 절편의 경우 사이토키닌 첨가 배지에서 배양 4 주 후부터 직접 체세포배가 유도되기 시작하였다. TDZ의 경우 3.0 ㎎/ℓ의 고농도 처리에서 12.5%의 체세포배발생이 유도되었으나, picloram 처리에서는 흰색의 비배발생캘러스 만이 형성되었다.

위의 결과와 같이 첨가된 호르몬의 종류 및 농도 뿐만 아니라 절편의 종류에 따라서도 체세포배발생의 효율 그리고 유도 기간이 현저히 차이가 나는 것을 확인하였다. 또한 엽 절편에서는 엽병 그리고 뿌리 절편과 비교하여 체세포배발생 유도율이 50% 이상 우수한 것을 확인하였다.

이전의 연구에서 일천궁 체세포배발생의 경우 미숙화기 혹은 절간 절편에서 체세포배 발생 유도 효율이 가장 높았으며, 2,4-D 혹은 BA 단독 처리와 두 가지를 혼합 처리 시 유도율이 높았다고 보고된 바 있으나 (Cho et al., 2000; Lee et al., 2009), 본 연구에서는 기내배양체의 엽 절편에서 95% 이상의 높은 체세포배발생 유도율을 보였으며, 기존 보고된 호르몬인 2,4-D와 BA 이외에 kinetin 처리에서 높은 유도효율을 나타내었다.

천궁과 같은 미나리과 (Apiaceae)에 속하는 탑시아가르가니카 (Thapsia garganica)는 1.0 ㎎/ℓ의 2,4-D를 단독 처리 시 잎 절편으로부터 체세포배 발생 유도율이 가장 높았으며 (Anne et al., 1993), 고수 (Coriandrum sativum L.)는 1.0 ㎎/ℓ의 2,4-D와 1.0 ㎎/ℓ의 kinetin을 혼합 처리한 배지에서 배축 절편으로부터 체세포배발생이 가장 적정하다고 보고된 바 있다 (Mujib et al., 2014) 또한 아조완 (Carum copticum L.)은 0.5 ㎎/ℓ의 2,4-D와 1.0 ㎎/ℓ의 kinetin이 혼합 처리된 배지에 배축 절편에서 (Niazian et al., 2017), 야생샐러리 (Kelussia odorotissima)의 경우, 1.0 ㎎/ℓ의 2,4-D와 0.25 ㎎/ℓ의 kinetin 혼합 처리한 배지에 자엽절편을 사용한 것에서 체세포배 발생 유도 효율이 가장 높다고 보고하였다 (Ebrahimi et al., 2018).

이와 같이 미나리과 (Apiaceae)에 속하는 식물체의 체세포 배유도의 경우 2,4-D와 더불어 공통적으로 kinetin이 첨가된 배지에서 유도 효율이 높은 것으로 보고되고 있으며 본 연구결과에서도 kinetin 단독 처리 시 일천궁의 엽 절편에서 체세포배발생 유도효율이 가장 좋은 것으로 확인되었다.

유도된 체세포배의 발아를 위해 1/2 MS 호르몬 무처리 배지 조건에 어뢰형에서 자엽 단계의 체세포배를 접종하였다. 기내식물체를 유도한 결과 직접 체세포배발생을 통해 유도된 엽, 엽병 그리고 뿌리 절편 유래 체세포배는 배양 4 주 이후 절편체로 부터 직접 발아 식물체로 생육하는 것이 관찰되었다 (Fig. 1D).

간접 체세포배발생으로 유도된 엽, 엽병 그리고 뿌리 절편 유래 어뢰형에서 자엽단계 이상의 체세포배는 배양 5 주 이후 체세포배 발아를 거쳐 유식물체로 발달되었다. 발아 배지에서 생육한 체세포배 유래 식물체는 90% 이상 정상적인 식물체로 생육하였다 (Fig. 1E).

직·간접 체세포배발생 유래 기내식물체의 순화율은 80% 이상으로 순화 30 일 후 온실로 이동하여 생육시켰다. 그 결과 펄라이트를 단독 사용한 인공상토에서 생육한 식물체의 생존율이 펄라이트와 버미큘라이트를 혼합한 인공상토 대비 높게 나타났다. 펄라이트와 버미큘라이트 혼합 처리에서는 1 번 라인 73.3%, 2 번 라인 33.3%, 3 번 라인 10.0%, 4 번 라인 100%로 생존율을 보였다. 펄라이트 단독 처리에서는 1 번 라인 93.3%, 2 번 라인 86.7％, 3 번 라인 73.3%, 4 번 라인 100%를 보여 4 번 라인을 제외한 처리에서 펄라이트 단독 처리가 효과적임을 확인하였다 (Table 4).

본 연구 결과는 종자로 번식이 어려운 천궁의 체세포배 발생 유도 방법을 이용하여 균일하고 안정적인 종묘의 생산이 가능하며 대량생산과 신품종 개발연구에도 활용될 수 있을 것이다. 또한 일천궁의 체세포배 발생 유도 연구는 엽과 뿌리 절편체를 이용한 연구가 이루어진 바가 없었으므로 향후 일천궁 체세포배발생을 위한 기본자료로 활용될 수 있을 것으로 생각된다.