추출방법에 따른 아로니아 추출물의 주름 개선 효능 비교

1. 시료 제조

추출에 사용 된 아로니아 열매는 2013년도 산 충북 단양군 농업기술센터부터 지원받아 사용하였다. 아로니아 시료의 추 출은 수직 환류냉각기가 설치되어있는 flask에, 열수추출의 경 우 1ℓ의 증류수에 아로니아 열매를 100 g을 사용하여 100°C 에서 24시간 추출하였으며, 에탄올 추출물은 같은 조건에서 용 매를 70% 에탄올로 하여 60°C에서 24시간 추출하고, 초음파 추출물은 70% 에탄올을 사용하여 추출한 시료에서 초음파 추 출기 (AUG-R3-900, ASIA ULTRASONIC, Korea)를 통하여, 120 kHz의 초음파에서 30분 추출을 실시하였다. 추출 한 모든 아로니아 시료는 감압여과기를 사용하여 여과하였다. 여과 후 에 회전식 감압농축기 (EYELA N-1000, Tokyo Rikakikai Co., Japan)로 농축한 후, 동결건조기 (PVTFA 10AT, ILSIN, Korea)에 72시간동안 동결 건조하여 분말로 만들어 실험을 진 행하였다.

2. 세포 및 시약

HDF (Human dermal fibroblasts)는 CCD-986sk으로 한국 세포주은행 (KCLB, Seoul, Korea)에서 동결 된 것으로 구입 하였다. 구입한 CCD-986sk은 DMEM 배지에 10% fetal bovine serum (Gibco, Carlsbad, CA, USA)을 첨가하여 37°C, 5% CO2 조건하에서 배양하였다. 그 외 사용된 모든 시약들은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)을 통하여 구입, 사용하였다.

3. DPPH 자유 라디칼 소거능을 이용한 항산화능 측정

DPPH (α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl) 자유 라디칼 소거활 성은 Dietz (Dietz et al., 2005)의 방법을 사용하되 실험방법 을 변형하여 실험하였다. 용매를 methanol로 제조한 0.1 mM DPPH용액 150µl을 첨가 후 각 공정 별 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0mg/ml 농도의 아로니아 시료 150µl을 혼합하여 25°C에서 30분 동안 암실에 방치 한 후 517nm의 파장에서 흡광도 측 정하였다. 측정한 값은 DPPH radical scavenging activity (%)로 나타내었다.

DPPH radical scavenging activity(%) =controlO.D.-samplecontrolO.D×100

4. MTT 용액을 이용한 세포 독성평가

MTT용액은 3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT, Sigma-Aldrich, USA) 시약을 사용하였다. 독성 평가에는 HDF세포인 CCD-986sk를 사용하였으며, 세포를 3.0 × 106 cells/well 농도로 96-well plate에 주입한 뒤 24시간 동안 세포를 부착하였다. 24시간 뒤 배지를 제거하고 아로니 아 시료를 농도별로 200µl만큼 투여하고 CO2 배양기에서 다 시 한 번 24 시간 동안 반응시킨다. 24시간이 지난 다음 시 료를 제거하고, 200µg/ml 농도의 MTT 용액을 각 well에 첨 가하고 37°C의 암실에서 3시간 동안 배양한다. 그 후 PBS buffer로 2회 세척하고, DMSO를 well에 200µl 주입한 뒤 microplate reader (Thermo Fisher Scientific, USA)로 570nm 에서 흡광도를 측정하여 세포독성 (%)으로 나타내었다.

5. Human Dermal Fibroblast (HDF)를 이용한 Collagen 생성능 실험

HDF세포는 CCD-986sk를 이용하였으며, collagen 생성능 측 정은 Procollagen Type I C-peptide (PIP) EIA Kit (Takara, Otsu, Japan) 을 사용하여 실험을 진행하였다. 키트에 준비 된 plate에 Antibody-POD Conjugate Solution을 100µl 넣고, 아로니아 샘플을 농도별로 20µl를 첨가한다. 첨가한 후 plate에 빛을 차단하기 위해 호일로 감싼 뒤 37°C에서 3시간 동안 배양한다. 3시간이 지나면 배양액을 제거한 뒤, washing buffer를 400 µl를 주입하여 총 4회 세척한다. 세척 이 끝나면 substrate solution을 각 well에 넣고 20 ~ 30°C에서 15분간 다시 배양한다. 배양이 끝나면 stop solution인 1 N H₂SO₄을 100µl넣고, plate를 흔들어준 뒤 microplate reader (Thermo Fisher Scientific, USA)로 450nm에서 흡광도를 측 정하였으며, standard solution을 사용한 standard curve를 이용하여 정량하였다.

6. MMP-1 생성 실험

MMP-1 생성 실험은 Human MMP-1 ELISA Kit (Ray Biotech, Norcross, USA)를 사용하였다. 사용 전 모든 시약 및 샘플을 18 ~ 25°C로 맞춰놓고 실험을 진행하였다. 키트에 준비 된 plate에 샘플과 standard를 100µl 만큼 각 well에 주입 한 뒤 커버를 덮고 상온에서 2시간 30분 동안 배양한다. 그 뒤 배양액을 버리고 wash buffer로 4회 반복하여 세척한 후 Detection Antibody MMP-1을 100µl 만큼 각 well에 주 입하고 한 시간 동안 상온에서 배양한다. 배양이 끝나면 다시 배양액을 버리고 4회 세척한 뒤 Streptavidin solution을 넣고 45분동안 상온에서 shaking해준다. 그 뒤에 마찬가지로 배양액 을 제거하고 세척하고 substrate reagent를 주입한 후 30분동 안 암실에서 온도는 상온에서 배양한다. 배양이 끝나면 마지 막으로 stop solution을 50µl 넣어 반응을 종결시키고 즉시 450nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

7. 통계처리

모든 실험의 데이터 통계처리는 3회 반복하였으며, 실험값 의 통계는 SAS (Statistical Analysis System) 프로그램을 통 하여 two-way ANOVA 방법으로 처리하였다. 처리구간의 최 소 유의 수준의 차는 p < 0.05로 처리 하였다.

1. DPPH 자유라디칼 소거능

아로니아 추출물의 항산화능을 확인하기 위하여 DPPH 자 유라디칼 소거능을 측정하였으며, Table 1에 측정 된 결과를 표시하였다. DPPH는 517nm에서 최대 흡광도를 나타내고, 환 원을 하게 되면 517nm에서 흡광도가 감소한다.

아로니아 시료와 대표적인 항산화물질로 알려진 ascorbic acid을 비교해 보았을 때 양성대조군인 ascorbic acid는 0.2mg/ml의 농도에서 88.2%의 DPPH 자유라디칼 소거능을 보 였으며, 아로니아 시료 1.0mg/ml의 농도에서 열수 추출물 (WE)의 경우 84.2%의 자유라디칼 소거능을 나타내었고, 70% 에탄올 추출물 (EE)은 84.3%로 WE와 유의적인 차이가 없 었다. 가장 높은 소거활성을 보인 초음파 공정을 거친 에탄올 추출물 (UEE)의 경우에는 90.4%로 기타 다른 추출법에 비해 유의적인 차이를 보였으며 농도차가 있긴 하나, 양성대조군인 ascorbic acid 보다도 높은 항산화능을 나타내었다. 농도가 증 가함에 따라 DPPH 소거능이 증가하였다. 이와 같은 결과를 보았을 때, 아로니아 시료들은 전반적으로 항산화능이 높았으 며 그 중에서도 초음파공정을 거친 아로니아 시료가 활성이 가장 좋았음을 알 수 있었다. 항산화능이 높으면 활성산소를 감소시켜 피부의 항 주름의 효능을 확인 한 선행연구를 바탕 으로 하여 (Jang et al., 2013), 아로니아 시료를 이용하여, 피 부의 탄력을 유지시켜주는 단백질인 collagen 생성능에 대한 실험으로 주름개선효능에 대한 평가를 진행하였다.

2. MTT용액을 이용한 세포 독성평가

주름개선 활성 평가를 하기 전 실험으로 정상세포에 대한 독성을 알아보기 위해 섬유아세포인 CCD-986sk 세포를 이용 하여 세포 독성을 확인한 결과를 Fig. 1에 나타내었다. 그 결 과 아로니아 시료 중 독성이 가장 높은 추출물은 초음파 공정 을 이용한 아로니아 추출물로 독성이 14.62% 인 것으로 측정 되었다. 이 측정 된 결과 값은 앞으로의 세포실험을 진행하는 데 있어 아로니아 시료에 대한 세포독성이 실험에 큰 영향을 끼칠 만큼 높지 않은 것으로 판단하였다. 향장연구에 관련 된 다른 천연물인 더덕추출물에 대한 연구와 비교하였을 때 10 ~ 20%의 세포독성을 가지는 것으로 볼 때 (Kim et al., 2013), 마찬가지로 세포독성은 높지 않았다. 이를 이용하여 HDF (Human Dermal Fibroblasts)인 CCD-986sk를 통해 피 부의 탄력을 유지하는 collagen 단백질 및 collagen 단백질을 저해하여 피부의 주름증가에 원인이 되는 효소 MMP-1 (Matrix metalloproteinase-1)의 생성량에 대한 실험을 진행하여 아로니아 시료에 대한 주름개선효과를 확인하여 각 추출별로 결과 값을 비교하였다.

3. Collagen 생성능 실험

아로니아 시료의 주름개선에 대한 효능을 알아보기 위하여, collagen 생성능 실험을 진행하였으며, 결과는 Fig. 2에 나타내 었다. 그 결과, 각각의 모든 시료는 5가지의 농도차에 따라 전 부 유의차를 보이며 농도 의존적으로 생성량이 증가하는 양상 을 보였고, 아로니아 시료의 가장 높은 농도인 1.0mg/ml의 농 도에서 열수 추출물은 53.5 ng/ml의 collagen이 생성되었으며, 70% 에탄올 초음파의 collagen 생성량은 224.4 ng/ml, 초음파 공정을 이용한 에탄올 초음파는 245 ng/ml로 다른 아로니아 시료들과 비교하였을 때 가장 높은 생성량을 확인하였다. 열 수 추출물, 에탄올 추출물, 초음파 공정을 거친 에탄올 추출물 서로간의 충분한 유의차를 보였다. 주름개선에 효능이 있다고 보고 된 포도와 오이즙액을 이용한 동충하초 균사체 연구와 비교하였을 때 동충하초 균사체의 경우 150 ~ 200 ng/ml의 collagen이 생성되는 것으로 보아 아로니아 추출물의 주름개선 효능이 우수함을 확인하였으며 (Lee et al., 2006), 또한 같은 용매의 추출물이더라도 초음파 공정을 이용하였을 때 아로니 아 시료의 주름개선 효능이 증가하였음을 알 수 있었다. 이는 앞서 실험한 항산화능을 알아보는 DPPH 실험과 비교하였을 때, 초음파 공정을 거친 시료가 항산화능이 가장 높은 결과를 나타낸 것과 같은 양상을 보였다. 지금까지의 결과를 확인하 였을 때 항산화능이 높을수록 주름개선에 효능이 있음을 확인 할 수 있었으며, 초음파 공정을 거친 아로니아 시료가 가장 활성이 높은 것을 알 수 있었다. 이에 더하여, 또 다른 주름 개선효능을 알 수 있는 실험으로 collagen 생성을 저해하는 효 소인 MMP-1의 생성 실험을 통하여 주름개선효능에 대하여 추가적으로 확인해 보기로 하였다.

4. MMP-1 (Matrix Metalloproteinase-1) 생성 실험

MMP-1은 피부에 탄력을 주는 단백질인 collagen을 분해하 는 효소로 MMP-1의 생성량이 낮을수록 주름개선에 대한 효 능이 좋은 것으로 판단할 수 있다. MMP-1의 생성량을 확인 한 실험의 결과는 Fig. 3에 표시하였다. 모든 샘플이 농도에 따라 유의적인 차이를 보이며 MMP-1의 생성량이 감소하 는 양상을 확인하였다. 아로니아 시료의 가장 높은 농도인 1.0mg/ml 에서 아로니아 열수 추출물은 102.3 pg/ml의 생성량 을 확인하였으며 70% 에탄올 추출물은 34.6 pg/ml의 생성량 으로 열수 추출물의 MMP-1 생성량 보다도 큰 유의적인 차 이를 보였다. 초음파 공정을 거친 70% 에탄올 추출물은 22.5 pg/ml로 가장 낮은 MMP-1의 생성량을 확인하였다. MMP-1의 생성량이 열수 추출물, 에탄올 추출물, 초음파 공정 을 거친 에탄올 추출물 순으로 모두 유의적인 차이를 보이며 낮게 나타났으며, 주름개선에는 역순으로 효능이 뛰어남을 확 인하였다. 주름개선효능이 뛰어나다고 알려진 황철나무, 산수 유, 구기자의 초임계 추출물의 연구와 비교하였을 때 (Shin et al., 2013), 황철나무와 산수유, 구기자 초임계 추출물은 농도 가 10배 낮은 0.1 mg/ml에서 20 ~ 35 ng/ml의 MMP-1의 생성 량이 측정되었다. 아로니아 추출물의 농도가 10배가 더 높긴 하나 MMP-1의 생성량이 1000배 이상 낮은 것으로 보아 아 로니아 추출물이 MMP-1의 생성량 저해에 활성이 더 좋은 것 을 알 수 있었으며, 주름개선에 뛰어난 효능이 있음을 알 수 있었다. 또한, collagen 생성 실험결과와 마찬가지로 항산화능 이 뛰어날 수록 MMP-1에 대한 저해활성도 좋은 것으로 판단 되었으며, 초음파 공정을 이용한 추출물이 여타 공정법들보다 활성이 가장 뛰어나, 주름개선효능에 가장 좋은 것을 확인할 수 있었다.

앞서 언급한대로 활성산소는 피부탄력을 유지하는 collagen 단백질의 생성을 저해하여 탄력을 저하시켜 피부주름증가에 큰 원인이 된다. 또한 자외선에 영향을 받은 피부에서 활성산 소에 의해 collagen 단백질을 분해하는 효소인 MMP-1을 분 비함으로서, 피부의 주름이 증가하게 된다. 본 연구에서는 아 로니아 추출물로 활성산소를 제거하는 능력인 항산화능을 평 가하여, 이를 근거로 주름개선에 우수한 효능이 있음을 확인 하였다. 아로니아 속에 항산화능이 뛰어나다고 잘 알려진 안 토시아닌류 성분들이 주름개선효과에 지대한 영향을 끼친 것 으로 사료되며, 시료들 중에서도 초음파 공정을 통한 아로니 아 추출물의 효능이 여타 공정 법들 보다도 큰 효능을 보였다. 아로니아 속 성분물질인 안토시아닌 및 기타 활성물질이 저온 을 통한 초음파 공정으로 인하여, 다른 공정 법보다 활성물질 의 변성 및 파괴가 적어 성분물질의 보존 및 용출이 잘 되어 뛰어난 효능을 보인 것을 알 수 있었다. 이를 통하여 초음파 공정을 거친 아로니아 시료의 주름개선효능의 증진을 확인하 였으며, 아로니아의 향장소재로서 가능성을 입증하였다.